一种大型实验动物克隆化细胞诱导为多能性干细胞的方法技术

本发明专利技术利用大型实验动物克隆化细胞为靶细胞进行多能性干细胞的诱导、体外培养条件优化及功能验证，最终获得高增值力、高分化潜能的大型实验动物多能性干细胞，属于动物资源学和细胞生物学交叉学科和领域。本发明专利技术培养出的多能性干细胞无污染，细胞纯度高；细胞质量稳定，传代生长稳定，适合大规模培养。本发明专利技术涉及的大型实验动物多能性干细胞可有效的对同一研究对象进行持久的连续性的研究，为生命科学研究提供性状恒定的研究对象，可作为细胞工程和组织工程等研究领域的标准细胞，用于生命科学研究的多个领域，对我国生命科学的研究具有深远意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多能性干细胞的诱导方法，具体地说是利用大型实验动物克隆化细胞为靶细胞进行多能性干细胞的诱导、体外培养条件优化及功能验证，最终获得高增值力、高分化潜能的大型实验动物多能性干细胞，属于动物资源学和细胞生物学交叉学科和领域。
技术介绍
随着医学生物科学的突飞猛进发展，认识到公害问题不仅已成为粮食、人口、老年人等的重大社会问题，而且还涉及到地球上生活着的动物生存问题，例如产业公害、食品公害、药品毒性等，均直接影响人体健康，对这些问题的研究，最终必然要通过动物实验(包括动物疾病模型的开发等)来阐明解决。因此，实验动物科学，特别是实验动物的重要性愈来愈被人们所认识，它已被认为是动物追求幸福生活的支柱，故实验动物科学亦被称之为生命科学。为此，先进国家对实验动物科学的发展，均给给予高度的重视，其投入的经济物资和技术力量，几乎可同发展原子能科学相提并论，其重要意义可想而知。动物细胞在体外的生存周期是有限的，正常组织来源的体细胞在通常的体外培养条件下可生长和分裂，但经过有限次的细胞传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡。这无疑又局限了其在生物技术和临床研究方面的应用。在实际操作中对于相同样本反复采集也是不可能的，一次性大量取样则更不人道。但是，在传统的方法中，研究的接力式进行和标本的暂时性的采集中存在的矛盾很难调和，所以建立和保存实验动物的多能性干细胞，可有效的对同一研究对象进行持久的连续性的研究。多能性干细胞具有稳定的增殖特性和功能状态，能为生命科学研究提供性状恒定的研究对象，可作为细胞工程和组织工程等研究领域的标准细胞，已应用于生命科学研究的多个领域。在众多转化体外细胞使其永生化的方法技术中，我们常以采集样本方便，病毒转化永生化细胞率高，操作周期短的EB病`毒转化外周血B淋巴细胞建立永生细胞系，为保存实验动物基因，研究影响动物疾病基因的最合适方法。EB病毒转化实验动物外周血B淋巴细胞建立的永生细胞株让原本有一定寿命的动物细胞能够不间断地繁殖下去，使各个领域实验动物的基因得以永久的保存。永生细胞株在转化前后其细胞和分子遗传学是稳定的，但细胞株在长期传代的过程中遗传特征是否发生改变，是一个关系着科学研究中实验结果准确性的重要问题，也是我们继续研究的方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案:采用高活性、高纯度的大型实验动物克隆化细胞为靶细胞，该细胞具有以下特征:生长速度快，活率高，凋亡率低。大型实验动物多能性干细胞的诱导方法包括下述步骤:(I)克隆化细胞培养:以悬浮细胞培养法为基础，转化与24孔板少量培养时采用全 RPM11640 培养基 A:78 % 基础 RPMI1640+20 % FBS(GIBC0 特级)+1 % 双抗 +1 %L-Giutamine+0.2%H印es (调节pH至7.0);永生细胞转入中瓶后使用全RPMI1640。培养基 B:73%基础 RPMI1640+15% FBS (BIOCHROM AG 优级)+1 %双抗+1 % L-Giutamine+0.2%Hepes (调解pH至7.0)。37.5°C、5% CO2培养体系对永生化细胞进行转化与培养。(2)多能性干细胞的诱导:三因子无饲养层体系诱导大型实验动物多能性干细胞。(3)多能性干细胞的培养体系优化:在培养体系中添加LIF和bFGF等因子及采用STO饲养层等对多能干细胞的培养体系进行优化。(4)多能性干细胞的鉴定:采用形态学观察、体外增值能力测定、碱性磷酸酶染色和免疫荧光鉴定大型实验动物多能干细胞。本专利技术的优点与效益:本 专利技术对传统的四因子诱导多能干细胞方法及培养液成分进行调整与改进，可以高效诱导出大型实验动物多能性干细胞，细胞质量与现有技术相比有大幅提高；改进培养条件后，大型实验动物多能性干细胞形态和生长速度没有发生变化，细胞质量稳定，且细胞传代生长稳定，与现有培养技术相比有显著提高，适合大规模培养。诱导方法的调整及培养方法的改进，大幅降低了成本。本专利技术在方法等各方面弥补了现有多能干细胞技术的不足，大型实验动物多能性干细胞的细胞活率及纯度的提升也使实验动物的基因得以永久的保存。由于大型实验动物为有别于其他动物的一类特殊群体，他们所特有的基因成了及其珍贵的遗传资源，使得人们在各领域内对大型实验动物的研究极少。本专利技术所述的高增值力、高分化潜能的大型实验动物多能性干细胞可有效的对同一研究对象进行持久的连续性的研究，为生命科学研究提供性状恒定的研究对象，可作为细胞工程和组织工程等研究领域的标准细胞，用于生命科学研究的多个领域，对我国生命科学的研究具有深远意义。下面结合附图及最佳实施方式对本专利技术做进一步说明，以使公众对
技术实现思路
有整体和充分的了解，而并非对本专利技术保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本专利技术可以实施的保护范围，因此凡依照本专利技术公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本专利技术的侵犯。附图说明图1为0CT4慢病毒载体转染293T细胞；图2为S0X2慢病毒载体转染293T细胞；图3为C-MYC慢病毒载体转染293T细胞；图4为KLF4慢病毒载体转染293T细胞；图5为RTTA慢病毒载体转染293T细胞；图6为0CT4慢病毒滴度测定；图7为S0X2慢病毒滴度测定；图8为C-MYC慢病毒滴度测定；图9为KLF4慢病毒滴度测定；图10为RTTA慢病毒滴度测定；图11为大型实验动物克隆化细胞；图12为诱导的大型实验动物多能干细胞；图13为大型实验动物多能干细胞碱性磷酸酶染色；图14为大型实验动物多能干细胞oct4免疫荧光鉴定图15为大型实验动物多能干细胞SOX2免疫荧光鉴定图16为大型实验动物多能干细胞nanog免疫荧光鉴定图17为大型实验动物多能干细胞SSEAl免疫荧光鉴定具体实施例方式实施例中所用的主要仪器及试剂来源:大型实验动物主要是牛、羊的克隆化细胞来源:本实验室保存。(一 )主要仪器设备1、激光扫描共聚焦显微镜:尼康TE-2000-E ；2、细胞融合 仪:美国BTX ECM-20013、显微操作仪:日本尼康NT-88-V34、浮雕相差显微镜，Olympus IX-71 ;生物显微镜，Olympus CX31 ;倒置相差荧光显微镜:01ympus IX-71 ；5、_70°C超低温冰箱:美国 kelvinator ；6、电动移液器:德国Accu-jet ；7、颇尔超纯水器:Pall-pruelab_plus ；8、CO2 培养箱:Heraeus BB16UV ；9、液氮贮存器:四川东亚YES-50B-125F ；10、电泳仪:北京六一厂DYY-6C;11、电泳槽:北京六一厂DYC-24A:12、高性能无菌实验台:哈尔滨DL-CJ-2N ；13、低速离心机:CENTERIGUGETDL-40B ；( 二)主要试剂1、DMEM(Dulbecco， s modified eagle medium):2、载体 pEGEP_N3:Clontech ；3、膜蛋白酶(Trypsinl:250),吉姆萨(Giemsa): Amresco ；4、特级胎牛血清(Defined FBS):Hyclone ；5、台盼蓝(Trypan Blue), DMS0,秋水仙素(Colchicine), ED本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大型实验动物克隆化细胞诱导为多能性干细胞的方法。

【技术特征摘要】
1.一种大型实验动物克隆化细胞诱导为多能性干细胞的方法。2.如权利要求1所述方法，其主要特征是采用三因子无饲养层体系诱导大型实验动物多能性干细胞。本发明对传统的四因子诱导多能干细胞方法及培养液成分进行调整与改进，采用S0X2、C-MYC和KLF4慢病毒可以高效诱导出大型实验动物多能性干细胞，细胞质...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡鹏飞，白春雨，李向臣，姜龙江，李万哲，刘春华，关伟军，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，哈尔滨体育学院，
类型：发明
国别省市：