一种丝氨酸蛋白酶编码基因和重组酶及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种丝氨酸蛋白酶编码基因和重组酶及应用，属于生物技术领域。一种丝氨酸蛋白酶基因，其序列如SEQ?ID?NO.1所述，丝氨酸蛋白酶的重组酶，其序列如SEQ?ID?NO.2所述。实验证明，本发明专利技术的丝氨酸蛋白酶在温度为50℃，pH为5时酶活力最高，达到22.17U/mL，可耐受较高浓度的TritonX-100和Tween20而不影响其活力。本发明专利技术所提供的丝氨酸蛋白酶编码基因和重组酶可广泛应用于生物学研究、食品加工、发酵生产等多个行业。

【技术实现步骤摘要】
—种丝氨酸蛋白酶编码基因和重组酶及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种丝氨酸蛋白酶编码基因和重组酶及应用。
技术介绍
丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，其主要作用是断裂大分子蛋白质中的肽键。核心结构由N结构域和C结构域构成。丝氨酸蛋白酶的催化位点和重要功能位点存在于这两个结构域间。丝氨酸蛋白酶的功能具有特异性和复杂性，所催化的底物特异性强。蛋白质在功能进化的过程中不仅要适应物种进化的外在环境，同时也要适应内在分化所产生的体内环境。在这过程中，丝氨酸蛋白酶也为适应一些新功能而产生了分化。目前，一些丝氨酸蛋白酶的结构已经被测定，其催化机制、活性部位也有研究。相关研究为利用蛋白质工程改造丝氨酸蛋白酶的研究提供了基础。有研究人员通过改变活性部位残基研究对催化性能的影响，比如Aspl02被Asn取代，验证了 Aspl02在催化机制中的作用；在哺乳动物体内，丝氨酸蛋白酶在消化、凝血和补体系统方面发挥着重要作用。丝氨酸蛋白酶在心血管疾病医治方面有广泛的应用；最近发现的一种分布于心脏的特异性II型跨膜丝氨酸蛋白酶，能将A型利钠肽前体(PiX) ANP)和B型利钠肽前体(pro-BNP)转化为ANP和BNP。研究发现，植物细胞中的丝氨酸蛋白酶在植物器官衰老过程中发挥着作用，多种植物的叶和花的衰老过程都与丝氨酸蛋白酶基因表达相关联；真菌基础上的丝氨酸蛋白酶研究也有应用，通过芯片技术结合免疫组化方法，不仅能够检测多种新生隐球菌菌株细胞中丝氨酸蛋白酶的表达分布，还可以横向对比丝氨酸蛋白酶在新生隐球菌致病过程中的作用。新型丝氨酸蛋白酶的研究与开发是获得特异性丝氨酸蛋白酶的基础。目前对细菌中新型丝氨酸蛋白酶的开发较少，在Pantoea ananatis中的研究未有报道。随着分子生物学、基因工程的迅猛发展，研究人员开始应用基因工程技术构建新型丝氨酸蛋白酶降解菌株、开发新型丝氨酸蛋白酶，这将促进新型丝氨酸蛋白酶产品的开发与应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型丝氨酸蛋白酶编码基因ds的基因序列及其氨基酸序列。采用PCR方法克隆获得丝氨酸蛋白酶编码基因。本专利技术的一种新型丝氨酸蛋白酶编码基因ds，所述丝氨酸蛋白酶的基因序列为SEQ ID N0.1。所述丝氨酸蛋白酶的基因ds是一个完整的开放阅读框(0RF)，该开放阅读框以启始密码子ATG开始，以终止密码子TGA结束，共包括1062bp。本专利技术的一种新型丝氨酸蛋白酶，所述丝氨酸蛋白酶的重组酶氨基酸序列为SEQID N0.2。所述内切丝氨酸蛋白酶共352个氨基酸序列。本专利技术的另一目的，在于提供一种新型 重组丝氨酸蛋白酶DS。该重组酶的蛋白酶活性高，达到22.17U/mL。所述重组丝氨酸蛋白酶DS的制备方法，包括如下步骤:(I)重组菌株的构建:以 F:GAGCATATGTTTCTTAAACTCTTGCGT 和 R:ATCTCGAGCTACTGACTGCTGTCC 为 PCR 反应的引物；以PCR方法从菌株Pantoea ananatis P5(CGMCC N0.5356)基因组中克隆获得丝氨酸蛋白酶编码基因ds全长，以两种限制性内酶NdeI和XhoI将基因ds进行双酶切，并连接到原核表达载体PET中，构建成质粒pETDS，转化E.coli BL21感受态细胞，利用NdeI和XhoI双酶切，筛选获得重组菌株，构建成重组丝氨酸蛋白酶DS的表达菌株DS/BL21 (DE3)；(2)重组菌株的培养和重组丝氨酸蛋白酶的获得:将重组菌株DS/BL21 (DE3)接种到50mL LB (含30 μ g/mL卡那霉素)液体培养基中，在37°C震荡培养；待OD6tltl为·0.5时，加入0.1mM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h终止培养；将培养液在液氮中速冻，放冰水混合物里融化，使用超声波破碎细胞，10000r/min离心5min,取上清即为重组内切丝氨酸蛋白酶的酶液。本专利技术的再一目的，在于提供上述新型重组丝氨酸蛋白酶DS的应用。所述丝氨酸蛋白酶能够应用于蛋白质的降解。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点和有益效果:(I)根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶的分子量、等电点和酶学特性等特性与已知蛋白的差异判断，该重组丝氨酸蛋白酶DS的基因是一种新型丝氨酸蛋白酶基因。这是首次从Pantoea ananatis菌株中开发出重组丝氨酸蛋白酶基因。(2)该新型重组丝氨酸蛋白酶具有耐受高温和TritonX-100、Tween20的特点,在生物学研究、食品加工、发酵生产等多个行业中具有应用潜力。附图说明图1是内切葡聚糖酶基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图。M:D2000 ;重组内切葡聚糖酶基因以左侧箭头标出。图2是NdeI和XhoI双酶切质粒pETDS的琼脂糖凝胶电泳图。1:未切割质粒pETDS (阴性对照)；M =Marker0图3是菌落PCR检测重组表达质粒pETDS的琼脂糖凝胶电泳图。I:E.coli 菌落 PCR (阴性对照)；M:Marker ；2:pETDS/E.coli 菌落 PCR,箭头指示检测扩增出DS目的基因条带。图4是重组酶在不同温度的相对活性。图5是重组酶在不同pH的相对活性。具体实施方式1、材料(1)菌株菌株P.ananatis P5 (CGMCC N0.5356)，所述菌株 P.ananatis P5 保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏号=CGMCC N0.5356。大肠埃希氏菌DH5 a、BL21购自北京索莱宝生物科技有限公司。(2)仪器美国ABI公司PCR扩增仪、德国SIGMA公司Sigma3_16pk台式高速冷冻离心机、低速离心机为常州国华电器有限公司产品、YXQ-LS-75立式压力蒸汽灭菌锅为上海博讯实业有限公司产品、FA2004电子天平为上海越平科学仪器有限公司产品、DNP-9162型电热恒温培养箱为上海精宏实验设备有限公司产品、美国BIO-RAD公司Gel Doc XR+凝胶成像系统、DYY-12型电泳仪为北京市六一仪器厂产品、7230G可见分光光度计为上海精密科学仪器有限公司产品、数显式电热恒温水浴锅为上海跃进医疗器械厂产品、超低温冰箱为日本三洋电子有限公司产品。2、基因克隆用于克隆丝氨酸蛋白酶基因引物序列为:F:GAGCATATGTTTCTTAAACTCTTGCGT和R: ATCTCGAGCTACTGA CTGCTGTCC。PCR 反应的扩增条件:90 °C 5min ；94 °C 30s, 54 °C 30s,72°C 90s，5 个循环；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 90s，25 个循；72°C IOmin0 PCR 扩增结果见图1o3、重组菌株的构建(I)基因和测序载体的连接与转化使用T4DNA Ligase将基因片段DS与测序载体pGMT进行连接。连接的体系如下:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组丝氨酸蛋白酶编码基因，其特征在于：所述酶基因序列为SEQ?ID?NO.1。

【技术特征摘要】
1.一种重组丝氨酸蛋白酶编码基因，其特征在于:所述酶基因序列为SEQ ID N0.1。2.根据权利要求1所述的一种丝氨酸蛋白酶编码基因，其特征在于:所述重组丝氨酸蛋白酶基因编码的氨基酸序列为SEQ ID N0.2。3.一种权利要求1或2所述的一种重组丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于: (1)重组丝氨酸蛋白酶菌株DS/BL21(DE3)的构建:使用引物 FDS:GAGCATATGTTTCTTAAACTCTTGCGT, RDS:ATCTCGAGCTACTGACTGCTGTCC ；以PCR方法从菌株Pantoea ananatis P5 (CGMCC N0.5356)基因组中克隆获得丝氨酸蛋白酶编码基因全长，将该基因通过限制性内酶NdeI和XhoI酶切后，连接到原核表达载体pET...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯进慧，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：