本发明专利技术涉及优秀冰雪运动员血液mRNA反转录技术，属于运动生理学、运动生化学、分子生物学交叉学科领域。提供了一种冰雪运动员血液mRNA反转录改进方法，该方法在血液mRNA提取中加入氯仿-异戊醇抽提方法，并且采用改良磁珠法进行mRNA纯化，采用高盐氯化钠-柠檬酸钠盐溶液漂洗生物素标记的Oligo(dT)探针配合低盐氯化钠-柠檬酸钠盐溶液漂洗生物素标记的Oligo(dT)探针-磁珠杂交体，mRNA收集率高，纯度高。本发明专利技术较传统血液mRNA提取、反转录的方法更为省时、简易、高效。为运动相关基因进一步的研究提供了丰富的材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及优秀冰雪运动员血液mRNA反转录技术，属于运动生理学、运动生化学、分子生物学交叉学科领域。
技术介绍
RNA反转录(reverse transcription)是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程,是DNA生物合成的一种特殊方式。1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶，该酶以RNA为核板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序(其中V与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转 录酶(reverse transcriptase)。后来发现反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3'术端上，按5' —3'方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA (complementary DNA, cDNA),它与RNA模板形成RNADNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。由于目的基因的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成DNA用以获得目的基因。通过RNA反转录技术获得目的基因已成为研究特定基因表达的常用的方法，基因在不同个体不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多样性，如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。探求基因表达的差异为我们揭示生命个体某种能力的差异提供依据。随着我国体育事业的快速发展，优秀冰雪运动员的不断涌现，为运动医学的深入研究带了契机，如果我国运动科学工作者充分利用现代分子生物学技术，了解优秀冰雪运动员相关运动基因的结构与功能，探明运动能力表型的基因标记，并定位这些基因，那么对冰雪运动员的运动能力预测、评定以及科学选材系统的建立将有十分重要的意义。目前，在基因定位及标记的技术层面上，多是通过基因多态分析、微卫星DNA等遗传标记的反向遗传学定位克隆策略，先获得某一表型在染色体上的定位，再在候选区选择已知基因，进行相关基因的筛选，以获得cDNA及全基因，而mRNA反转录技术则是构建cDNA文库的先行技术。优秀冰雪运动员外周血液样品易于采集，而且量少，不会对运动员产生损伤，血液mRNA的提取简易，反转录合成的cDNA的插入片段范围大，可用于cDNA文库构建，为优秀冰雪运动员运动相关基因进一步的研究提供丰富的材料。因此，优秀冰雪运动员血液mRNA反转录可为运动相关基因研究提供技术基础，能够推进运动医学分子领域的研究，进一步揭示优秀成绩的分子原因，从而推动祖国冰雪运动乃至整个体育事业的发展
技术实现思路
本专利技术提供简易、高效的优秀冰雪运动员血液mRNA反转录方法。为实现上述目的，本专利技术采取以下实验方案:本专利技术涉及优秀冰雪运动员血液mRNA的反转录，具体步骤为:(I)采集优秀冰雪运动员外周血液样本；(2)改良Trizol法提取血液mRNA。(3)改良磁珠法提纯血液mRNA ；(4)血液mRNA反转录。其中，步骤(1)选取现役冰雪运动员为样本采集对象；步骤(2)改良Trizol法以氯仿-异戊醇抽提和异丙醇沉淀为特征；步骤(3)改良磁珠法纯化mRNA以高盐氯化钠-柠檬酸钠盐溶液漂洗生物素标记的Oligo (dT)探针配合低盐氯化钠-柠檬酸钠盐溶液漂洗生物素标记的Oligo (dT)探·针-磁珠杂交体为特征，其中，高盐氯化钠-柠檬酸钠盐溶液为2X溶液，低盐氯化钠-柠檬酸钠盐溶液为0.1X溶液，使用高盐3XSSC漂洗生物素标记的Oligo (dT)探针能够洗去部分非特异性结合的探针，使用低盐0.1 X SSC漂洗生物素标记的Oligo (dT)探针-磁珠杂交体能够增加核酸链的严紧性，使得RNA/DNA之间的排斥力增加，得到纯度更高的mRNA。具体实施例方式UmRNA 的提取(I)取优秀冰雪运动员新鲜血液3ml ；(2)取Rnase 的 2mL离心管，加入9OO μ ITrizoI,加入 3O μ l5mol/L冰醋酸和 0.5ml新鲜全血，盖上离心管，震荡摇匀，室温静置5min。(3)加入等体积氯仿-异戊醇(24: I)，上下颠倒混匀10次，室温静置3min。4°C 12000r/min 离心 15min ；(4)取上层水相到另一离心管中，加入0.7倍体积异丙醇，混匀后室温静置IOmin ；(5) 4°C 12000r/min离心IOmin,去上清,用1111175%乙醇洗漆沉淀一次；(6) 37°C 5 IOmin 晾干乙醇；(7)将RNA溶于50 100 μ I无Rnase的DEPC处理过的水中。；2、磁珠法纯化mRNA(I)生物素标记的T重复寡核苷酸(Oligo dT)探针与mRNA的煺火①在DEPC处理过的1.5ml收集管中，加入0.2_lmg的总RNA和无Rnase的水至终体积为0.5ml。②65O加热 IOmin.③加入2 μ I生物素标记的Oligo (dT)探针和12 μ I的3X氯化钠_柠檬酸钠盐溶液(saline sodium citrate, SSC)于RNA中轻轻混勻，室温放置IOmin0(2)链酶抗生物素蛋白-磁珠的冲洗①将链酶抗生物素蛋白-磁珠轻晃开后，放入磁性分离架中，使磁珠集中于试管一侧小心去除上清，用1.5ml0.1 X SSC漂洗，用磁性分离架集中磁珠，去除上清，漂洗3次。②将漂洗过的磁珠重新悬浮于0.2ml0.1 X SSC中。(3)杂交体的生成及漂洗①将生物素标记的Oligo(dT)探针加入含磁珠收集管中轻轻混匀，室温放置IOmin0每隔2min轻轻混勻一次。②用磁性分离架捕获磁珠，吸弃上清。③用低盐0.1 X SSC漂洗磁珠，用磁性分离架集中磁珠，吸弃上清，漂洗4次。(4)洗涤收集 mRNA①将漂洗过的磁珠重新悬浮于0.2mlDEPC水中。②用磁性分离架捕获磁珠，将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次，吸取水相，两次水相合并。③在洗脱液中加入0.1体积的醋酸钠，I倍体积的异丙醇，_20°C沉淀过夜，12000r/min离心IOmin, 75%乙醇洗沉淀mRNA,干燥,溶解。3、mRNA 反转录(I)采用禽类白血病病毒反转录酶XL(AMV)进行反转录，反应体系如下:本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术提供了一种优秀冰雪运动员血液mRNA反转录方法，该方法主要是改良磁珠法纯化mRNA，通过以高盐氯化钠?柠檬酸钠盐溶液漂洗生物素标记的Oligo(dT)探针配合低盐氯化钠?柠檬酸钠盐溶液漂洗生物素标记的Oligo(dT)探针?磁珠杂交体为特征。
【技术特征摘要】
1.本发明提供了一种优秀冰雪运动员血液mRNA反转录方法，该方法主要是改良磁珠法纯化mRNA，通过以高盐氯化钠-柠檬酸钠盐溶液漂洗生物素标记的Oligo (dT)探针配合低盐氯化钠-柠檬酸钠盐溶液漂洗生物素标记的Oligo (dT)探针...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡萍，黄绥平，王飞，熊慧，孙婷婷，关伟军，
申请(专利权)人：哈尔滨体育学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。