一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用。一种β-葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；该β-葡萄糖苷酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。利用本发明专利技术所述的β-葡萄糖苷酶生产寡糖，与现有β-葡萄糖苷酶相比，反应速度明显加快，β-葡萄糖苷酶的最佳酶活温度更接近常温，在实际工业化生产中，有利于降低生产耗能，并且本发明专利技术所述的β-葡萄糖苷酶在重组菌株中表达量高，纯化过程简单，易于大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用，特别是一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与利用该酶生产寡糖的方法，属于生物技术和生物化工

技术介绍
寡糖是一种由2-10个单糖组成的低聚糖，其有着非常广泛的应用价值。如目前广泛应用于食品、保健品、饮料、医药、饲料添加剂等领域。美国、日本、欧洲等地均有规模化生产，我国低聚糖的开发和应用起于90年代中期，近几年发展迅猛。常见的寡糖包括麦芽低聚糖葡萄糖(α — I，4糖苷键结合)，龙胆二糖葡萄糖(β — I，6糖苷键结合)，低聚糖木糖(β —1，4糖苷键结合)等。目前制造龙胆二糖的技术方法主要包括以下两种:1、从天然原料中提取，但这种方法提取产量低，价格昂贵，无法满足工业化生产。2、酶法生产龙胆二糖，不过目前酶法生产龙胆二糖存在着酶活性效率低下，酶生产费用高昂等不便因素。目前酶法生产寡糖，是将单糖作为底物，利用糖苷酶生产寡糖。如中国专利文献CN101492661A(申请号200910029055.4)公开了一种β -葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备，该专利技术由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成β-葡萄糖苷酶基因(BGL)SEQID NO:1, BGL的CDNA以质粒PPIC9K为表达载体，以毕赤酵母(P.PAST0RIS)为表达宿主，实现BGL基因在胞外的可溶性表达；BGL的⑶NA全长2523个核苷酸，编码841个氨基酸，构建的BGL/PPIC9K转化P.PASTORIS KM71可表达BGL酶。BGL酶具有转糖苷活性，能将葡萄糖转糖苷生成龙胆低聚糖。但是该文献公开的酶生产寡糖所用时间过长，产物得率过低，无法满足生产要求。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一`种葡萄糖苷酶及其表达基因的高效生产与利用该酶生产寡糖的方法。专利技术概述本专利技术通过对里氏木霉菌株中产生的葡萄糖苷酶进行相关改造，发现其改造后的β_葡萄糖苷酶的作用产物的产量提高了 3.3倍。而且与报道的同类技术相比，产生相同产量寡糖所需的时间缩短了 4.8倍，最终产物得率提高了 25%。专利技术详述本专利技术技术方案如下:一种β -葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。一种β -葡萄糖苷酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。—种重组表达载体,是将如SEQ ID N0.1所不核苷酸序列插入表达载体获得。根据本专利技术优选的，所述表达载体为ΡΕΤ-32Α表达载体。一种重组细胞，是将上述重组表达载体转化入细胞中获得。根据本专利技术优选的，所述细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。一种利用β -葡萄糖苷酶生产寡糖的方法，步骤如下:将核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的基因片段导入到ρΕΤ-32Α质粒载体中，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过亲和层析色谱分离纯化制得β_葡萄糖苷酶，然后将β -葡萄糖苷酶加入以葡萄糖为底物的反应液中，在温度为30度，pH为6.0的条件下反应，获得寡糖。有益效果1、利用本专利技术所述的葡萄糖苷酶生产寡糖，与现有葡萄糖苷酶相比，反应速度明显加快。2、本专利技术所述的β -葡萄糖苷酶的最佳酶活温度更接近常温，在实际工业化生产中，有利于降低生产耗能。3、本专利技术所述的葡萄糖苷酶在重组菌株中表达量高，纯化过程简单，易于大规模工业化生产。附图说明 图1亲和层析纯化蛋白结果SDS-PAGE图谱；其中:M、marker, 1、大肠杆菌细胞破碎液,2、镍亲和层析柱洗脱峰,3、阴离子交换层析洗脱峰，4、阴离子交换层析洗脱峰。图2薄层层析分析寡糖产物成分；具体实施例方式下面通过实施 例对本专利技术的技术方案做进一步的阐述，应该说明的是，本说明的保护范围不仅限于此。里氏木霉(trichoderma reesei)QM6a购自美国标准生物品保藏中心,菌种保藏号ATCC N0.13631 ；Pet-32A质粒载体购自Novagen公司。实施例1:(I)里氏木霉QM6a总RNA的提取:里氏木霉QM6a菌株在加有2wt%微晶纤维素的MM培养基中培养2天，用滤纸过滤收集菌丝。将收集的菌丝放入预冷的研钵中研磨，其中研磨时加入一定的液氮。将研磨成的菌丝粉末移至1.5ml离心管中，并加入Iml RNAiso (购自生工生物工程有限公司B6402-1)于振荡器中震荡均勻，室温放5min。然后12000rpm离心lOmin。然后将上清吸到干净的1.5ml离心管中。然后加入160 μ I氯仿,震荡15s混勻，室温放置5min, 12000rpm, 4度离心5min。然后吸上清至新的1.5ml离心管。然后再加入800 μ I异丙醇，上下颠倒5次。室温放置lOmin，12000rpm，4度离心lOmin。弃上清。加入Iml预冷的75%乙醇清洗RNA，震荡后7500rpm离心5min。加入50 μ I DEPC处理过的水，溶解RNA。丽培养基组分如下:硫酸铵3g，磷酸二氢钾4.5g，硫酸镁0.18g，二水氯化钙0.24g尿素1.5g，1000X微量元素(七水硫酸铁5g/L，一水硫酸锰1.6g/L，七水硫酸锌1.4g/L，氯化钴 2g/L) 30 μ 1，用水补足至IJ 300ml。(2) β -葡萄糖苷酶编码基因的克隆:以里氏木霉QM6a总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA (购自takara反转录试剂盒 BK1201):①基因组DNA的去除反应按以下比例配制反应液:5 XgDNA Eraser Buffer 2 μ IgDNA EraserI μ ITotal RNA0.5 μ gRNAase Free ddH20up tolO μ I将上述反应液在42度条件下反应2min。 ②反转录反应:按以下比例配制反应液:5XPrimeScript Buffer24 μ IPrimeScript RT Enzyme Mix I I μ IRT Primer M ixI μ I步骤①配制的反应液10 μ IRNase Free ddH20up to20 μ I将上述反应液在37度反应15min，接着在85度反应5s。以F，R为上下游引物扩增出bgl基因:引物F: CCGGAATTCATGCCCGAGTCGCTAGCTCTGCCC ；引物R: CCCAAGCTTTGCCGCCACTTTAACCCTCTGC ；PCR 反应在 50μ I 体系中进行:2XPCR Buffer25 μ l,2mM dNTPslOyl，引物Fl.5 μ 1，引物Rl.5 μ 1，模板DNAl μ 1，KOD FX聚合酶I μ 1，加双蒸水补足到50 μ I。PCR反应体系:在94度变性2min后开始循环，然后98度变性10s，60度退火30s，68度延伸90s，共35个循环后，再于68度延伸lOmin，扩增得到PCR片段，割胶回收，回收片段连接在PET32A质粒载体上，连接位置在质粒载体的多克隆位点EcoRl和HindIII之间。连接产物转化大肠杆菌DH5 α，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37度培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，10个小时后提取质粒。(3) β-葡萄糖苷酶基因的改造将上述重组质粒中的葡萄糖苷酶基因进行定点突变，突变位点为I177S，I174S。首先突变位点I177S。以F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β?葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种β -葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.一种β -葡萄糖苷酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。3.一种重组表达载体，是将如SEQ ID N0.1所不核苷酸序列插入表达载体获得。4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为ΡΕΤ-32Α表达载体。5.一种重组细胞，是将权利要求3或4所述的重组表达载体转化入细胞中获得。6.如权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：方诩，高天龙，王明钰，刘奎美，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：