用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是用于扩增重组腺病毒时所用到的一套全面优化的工艺方法。该方法用聚纤维纸片载体利用生物反应器扩增人胚肾细胞（HEK293）从而建立腺病毒复制扩增的全套工艺流程。本发明专利技术建立在对5型腺病毒复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基，在病毒接种吸附后至20小时使用带5%的血清DMEM培养基，在收获病毒阶段采用无血清培养基添加0.25%的水解乳蛋白，同时每20小时补充2g/L的葡萄糖，采用批式收获换液的方式，该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，使优化工艺达到较高的病毒滴度。因此本发明专利技术所建立的优化工艺是具有良好重复性、高效重组腺病毒扩增工艺，可适用于任何以聚纤维纸片为载体的生物反应器扩增重组腺病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是用于扩增重组腺病毒时所用到的用生物反应器扩增重组腺病毒的一套优化的工艺方法。
技术介绍
人胚肾(HEK293)细胞是腺病毒载体的包装细胞，腺病毒是继逆转录病毒后用于基因治疗研究的热门载体.直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因，治疗恶性肿瘤，心血管疾病或一些遗传疾病已取得可喜进展；利用腺病毒载体在包装细胞HEK293中表达分泌性蛋白质，如蛋白酪氨酸激酶IC等亦成为生产重组蛋白的一条途径。2004年全球首例基因治疗产品“今又生”在中国上市，使腺病毒载体实现了在临床上的真正应用。因此完善HEK293细胞的大规模培养以及重组腺病毒大规模扩增技术具有越来越重要的市场意义。目前，国内病毒疫苗制备技术主要还是依靠转瓶(Rollingbottle)和细胞工厂(Cell factory),但是这些工艺方法存在大量局限，首先是劳动密集，所需空间大，产量较低，其次是无法对细胞生长的各种参数进行优化调节，例如酸碱度(PH)、温度和溶氧等。近些年，关于生物反应器用于病毒疫苗制备已有大量研究开发，比如中国专利(申请号:200710073190.X)，但其所用方法并未根据HEK293细胞生理特性和腺病毒的复制机制进行优化，另外在病毒培养阶段仍旧使用血清，这对于疫苗制备来说不够完善。要完善腺病毒载体扩增工艺首先必须建立在对HEK293细胞生理和生长特性的全面认识，以及对腺病毒感染细胞后的复制机理有全面把握。首先，细胞感染病毒前后会发生各种变化，如细胞干重、蛋白和核酸(DNA)含量、细胞大小都有不同程度的增加，293细胞在不含血清的培养基中，细胞感染病毒后直径从15um增至17um。在感染24小时，48小时后，细胞对葡萄糖的消耗以及氨 和乳酸的生成量均增加了 30%- 100%，氧气(O2)的消耗和三磷酸腺苷(ATP)的生成也有类似的趋势，这可能是因为除了细胞正常生长外，感染的过程需要更多的能量。因此，在培养病毒阶段更要注意营养物质的适度补给，一方面及时补充葡萄糖，因为在病毒扩增过程中，一旦葡萄糖耗竭会导致病毒扩增的停止。另一方面，根据氨基酸代谢的变化测定，适当补充最易消耗的几种氨基酸。根据“细胞密度效应”，病毒的产量未必跟细胞密度成正比，当细胞密度大于某个数量级，病毒产量不再增加，其原理尚未完全明确，可能与单位体积内营养物质的争夺和代理产物毒性有关。在腺病毒扩增的过程中，也同样存在最佳细胞密度，对于整个培养阶段而言，这个细胞密度的确定可以使得整个工艺流程变得简便、经济，从而更适用于工业开发相关广品。腺病毒的复制的最短周期大概在20小时左右，从与细胞表面受体结合，经过内吞作用进入细胞，然后是DNA的复制、转录和表达以及病毒的组装，这个过程最快一批病毒的产生在20小时左右。此外，尽管病毒开始吸附时候，病毒细胞数比值即感染复数(MOI)大于20，实际情况下仍有大量正常细胞未被感染，因此在20-22小时之间如果能再次在无血清培养基下让病毒继续吸附感染正常细胞将最终有利于病毒总体滴度的提高。由于在病毒培养阶段最好用不带有任何血清的培养基，因此探索一种较为廉价的无血清培养基非常关键。水解乳蛋白是一种安全有效的培养基添加剂，已有广泛的使用，在扩增腺病毒中目前尚无报导，如何确定其添加的浓度比例是一个值得摸索的方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是用聚纤维纸片(Fibra disk)为载体的生物反应器上最大程度优化重组腺病毒的生物反应器扩增工艺，已期获得更高滴度的重组腺病毒，并且稳定该工艺，达到重复性好，稳定性高的特点，最终能用于重组腺病毒产品的生产。本专利技术用聚纤维纸片(Fibra disk)载体利用生物反应器扩增人胚肾细胞(HEK293)，从而建立腺病毒复制扩增的全套工艺流程。对5型腺病毒复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的胎牛血清的DMEM培养基，培养细胞6-7天后换液成无血清培养基，吸附腺病毒2.5-3.5小时，加入3%-5%胎牛血清，继续培养20小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液(PBS)冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白，静止再吸附1.5-2.5小时以利于病毒再感染正常细胞，同时每20小时补充2g/L的葡萄糖，采用批式收获换液的方式，使优化工艺达到较高的病毒滴度。该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，尽量优化工艺达到较高的病毒滴度。因此本专利技术所建立的优化工艺是具有良好重复性、高效重组腺病毒扩增工艺，可适用于任何以Fibradisk为载体的生物反应器扩增重组腺病毒。用生物反应器大规模扩增重组腺病毒的一套优化工艺方法，具有如下步骤:1)在生物反应器内加入生长液，接种HEK293细胞，批次换液培养6-7天，密度达到5 X IO6个/ml以上，接种重组腺病毒，34°C静止吸附3小时，连续培养扩增病毒，每20小时左右批次换液收获；(2)100小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于1.6g/L，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒。(3)用300k中空纤维柱浓缩20-50倍，用于进一步纯化。本专利技术的技术方案为:应用生物反应器全面优化腺病毒大规模扩增工艺，具体步骤如下: (1)准备材料: 1.微载体:Fibradisk纸片载体150克； 2.细胞:本专利技术所选细胞为可以包装重组腺病毒的细胞，可以人胚肾细胞(HEK293)，A549，PER.C6，优选 HEK293，购自美国 ATCC ； 病毒:本专利技术所用病毒为重组5型腺病毒载体携带人乳头瘤病毒癌基因E6和E7(AdE6E7)融合蛋白基因，自行构建，亦可以是携带任何其他目的基因5型腺病毒，或其他型别腺病毒如Ad2，Ad6，Ad26，Ad35等；接种MOI在20-50之间； 细胞生长液:含体积浓度10%血清的DMEM培养基(美国Gibco公司)； 细胞维持液:含浓度0.25%水解乳蛋白(美国Gibco公司)的DMEM培养基(美国Gibco公司)； (2)细胞培养: 1.细胞工厂培养种子细胞和病毒:细胞复苏后，在flask细胞培养瓶子(美国Corning公司，)进行传代，每3天按1:3传，直至40瓶150mlflask培养瓶消化共得到5X IO8个细胞，接种到10层细胞工厂，(美国Corning公司)，底面积为640cm2，三天后消化得到1.5±0.3X IO9个细胞左右。从最初构建后在25cm2方瓶培养得到约为105IU/ml感染滴度的病毒，每次接种量即感染复数MOI在20-50之间，然后从75cm2扩增至150cm2，最后到细胞工厂(底面积640cm2)，得到种子病毒滴度大于109IU/ml ； (3)在生物反应器内加入生长液，接种HEK293细胞，批次换液培养6-7天，密度达到5-7 X IO6个/ml以上，换液成无血清DMEM培养基，接种重组腺病毒，34°C静止吸附3小时，然后加入5%的胎牛血清，继续培养20小时，换液成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白，再静止吸附2小时。接毒后收获方式采用批式收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为40、60、80和100小时，每20小时补充葡萄糖2g/L。生物反应器物理参数设定:(I)细胞培养阶段ρΗ7.1-7.5、温度37。。、溶氧50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法，其特征在于用聚纤维纸片载体利用生物反应器扩增人胚肾细胞HEK293，建立腺病毒复制扩增的工艺流程，对5型腺病毒复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的胎牛血清的DMEM培养基，培养细胞6?7天后换液成无血清培养基，吸附腺病毒2.5?3.5小时，加入3?5%胎牛血清，继续培养20小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白，静止再吸附1.5?2.5小时以利于病毒再感染正常细胞，同时每20小时补充2g/L的葡萄糖，采用批式收获换液的方式，使优化工艺达到较高的病毒滴度。

【技术特征摘要】
1.一种用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法，其特征在于用聚纤维纸片载体利用生物反应器扩增人胚肾细胞HEK293，建立腺病毒复制扩增的工艺流程，对5型腺病毒复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的胎牛血清的DMEM培养基，培养细胞6-7天后换液成无血清培养基，吸附腺病毒2.5-3.5小时，加入3-5%胎牛血清，继续培养20小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白，静止再吸附1.5-2.5小时以利于病毒再感染正常细胞，同时每20小时补充2g/L的葡萄糖，采用批式收获换液的方式，使优化工艺达到较高的病毒滴度。2.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法，其特征在于:具有如下步骤:1)在生物反应器内加入生长液，接种HEK293细胞，批次换液培养6-7天，密度达到5 X IO6个/ml以上，接种重组腺病毒，34°C静止吸附2.5-3.5小时，连续培养扩增病毒，每20小时左右批次换液收获；(2) 100小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈科达，吴洁，王一虎，姜云水，庄昉成，金素凤，高孟，张锋，李剑波，陈刚，毛子安，毛江森，
申请(专利权)人：浙江普康生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：