一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法技术

一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明专利技术包括如下步骤：选择4-氨基-3,5-二氯苯甲酸作为克伦特罗的半抗原，该分子与克伦特罗分子的同源性大于50%，将该半抗原与载体蛋白进行偶联，得到克伦特罗人工抗原。实验结果表明，用本发明专利技术的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达32000，检测限为1ng/mL，半抑制浓度IC50为10ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明专利技术的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的克伦特罗残留，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

一种高特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，属于生物化工

技术介绍
盐酸克伦特罗(Clenbuterol)，又称“瘦肉精”，是一种平喘药。是肾上腺类神经兴奋剂，20世纪80年代初，美国Cyanamid公司意外发现其有明显的促进生长、提高瘦肉率及减少脂肪的效果，于是其被畜牧业作为瘦肉精使用。但由于其副作用，欧共体于1988年I月I日起禁止盐酸克伦特罗物质当饲料添加剂使用。1991年被FDA禁止。1997年，中华人民共和国农业部下文严禁β -腎上腺素类激素在饲料和畜牧生产中使用，盐酸克伦特罗列为第一位，2002年9月10起在中国境内禁止在饲料和动物饮用水中使用盐酸克伦特罗。权利要求1.，其特征在于以4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸为半抗原，将4-氨基_3，5- 二氯苯甲酸上的羧基通过1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化、或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白进行偶联得到克伦特罗人工抗原，将人工抗原透析，工艺为: (A)将4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸用N，N- 二甲基甲酰胺DMF溶解，4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸与N-羟基琥珀酰亚胺NHS，1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC的摩尔比为1:1.5:2，在4°C避光搅拌反应lh，再在室温反应12h，得活化的半抗原溶液； 取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1MPH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N，N- 二甲基甲酰胺DMF的体积比例为5:1 ;将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原； 或(B)将4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸用N，N- 二甲基甲酰胺DMF溶解，4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸与三正丁胺，氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2，(TC反应lh，得活化的半抗原溶液； 取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1MPH9.6碳酸盐缓冲液溶解，(TC预冷30min，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1 ;在(TC条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0°C条件下反应Ih，然后室温反应24h ;用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原。2.根据权利要求1所述的特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，其特征在于，所述载体蛋白为:牛血清白蛋白BSA、阳离子化的牛血清白蛋白cBSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA之一种。3.根据权利要求1所述的特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，其特征在于克伦特罗人工抗原的分子结构式如式I所示:4.用权利要求1所述方法合成的特异性克伦特罗人工抗原的应用，其特征在于制备克伦特罗抗体，所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。5.用权利要求1所述方法合成的特异性克伦特罗人工抗原的应用，其特征在于在检测克伦特罗中的应用，检测食品中的克伦特罗残留。全文摘要，属于生物化工
本专利技术包括如下步骤选择4-氨基-3,5-二氯苯甲酸作为克伦特罗的半抗原，该分子与克伦特罗分子的同源性大于50%，将该半抗原与载体蛋白进行偶联，得到克伦特罗人工抗原。实验结果表明，用本专利技术的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达32000，检测限为1ng/mL，半抑制浓度IC50为10ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本专利技术的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的克伦特罗残留，具有广阔的应用前景。文档编号C07K14/765GK103159852SQ20131010359公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日专利技术者胥传来, 刘丽强, 王利兵, 匡华, 徐利广, 马伟, 胡拥明 申请人:江南大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，其特征在于以4?氨基?3,5?二氯苯甲酸为半抗原，将4?氨基?3,5?二氯苯甲酸上的羧基通过1?乙基?3?(3?二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N?羟基琥珀酰亚胺NHS活化、或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白进行偶联得到克伦特罗人工抗原，将人工抗原透析，工艺为：（A）将4?氨基?3,5?二氯苯甲酸用N,N?二甲基甲酰胺DMF溶解，4?氨基?3,5?二氯苯甲酸与N?羟基琥珀酰亚胺NHS，1?乙基?3?(3?二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC的摩尔比为1:1.5:2，在4℃避光搅拌反应1h，再在室温反应12h，得活化的半抗原溶液；取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1M?pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N?二甲基甲酰胺DMF的体积比例为5:1；将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原；或（B）将4?氨基?3,5?二氯苯甲酸用N,N?二甲基甲酰胺DMF溶解，4?氨基?3,5?二氯苯甲酸与三正丁胺，氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2，0℃反应1h，得活化的半抗原溶液；取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1M?pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N?二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1；在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，刘丽强，王利兵，匡华，徐利广，马伟，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：