本发明专利技术公开了高度灵敏的测定法，所述测定法组合免疫磁性富集与多参数流式细胞术或图像细胞术以检测、计数和表征血液中的恶性肿瘤细胞。本发明专利技术掺入不同抗体与相同铁磁流体的缀合。这具有就铁磁流体结合的抗原而言使得铁磁流体多特异性的效应。在相同铁磁流体上存在的多重抗体看起来不彼此封闭或另外干扰。此类铁磁流体具有能够与多于一种类型的细胞特异性结合的高度期望效应。所述测定法对于致使CTC捕获成为可能是尤其有用的，所述CTC具有低EpCAM表达，但具有其它肿瘤标记的高表达；因此，所述测定法便于恶性肿瘤细胞的生物表征和分期。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及肿瘤学和诊断测试领域。本专利技术用于癌症筛选、分期、监控化学疗法治疗应答、癌症复发等。更具体地，本专利技术提供了便于肿瘤细胞或从生物样品中分离的其它罕见细胞的分析和计数的试剂、方法和测试试剂盒。
技术介绍
使用CellSearchCTC测定法计数具有转移性乳腺、前列腺和结肠癌的患者中的循环肿瘤细胞(CTC)预测患者存活，且致使治疗应答的监控成为可能。另外，CTC可以就多种分子标记进行表征，所述分子标记已提议作为动态研究患者中的肿瘤生物学的方法。然而，已存在关于具有胰腺癌的患者中的CTC检测的少数研究，并且初步研究暗示最初测定法配置对于检测这些细胞可能不是最佳的(参见以引用的方式并入的US7，332，288)。最初CellSearch CTC测定法使用缀合至顺磁纳米颗粒的抗EpCAM(EpCAM铁磁流体)以捕获CTC0通过EpCAM铁磁流体捕获的CTC由缀合至藻红蛋白的抗细胞角蛋白抗体(CK8、18和19)染色，以检测CTC。除了来自不同癌症的细胞可能表达与乳腺、前列腺或结肠直肠癌那些相比较不同的肿瘤抗原的问题，存在描述在原发性肿瘤内的细胞异质性的增长中的文献。近期进展已显示肿瘤祖细胞(TPC)在解释一些癌症为何在化学疗法后恢复中可能是关键性重要的。这些TPC看起来对许多常规疗法是高度抗性的，并且能够在未来一定时间重建肿瘤。近来，文献也已鉴定可在转移过程中起主要作用的上皮间充质转化细胞(EMT)。认为TPC和EMT表达与CTC那些不同的抗原。CTC捕获依赖于在CTC上的EpCAM表达；因为CTC捕获已局限于单一捕获抗原。在CTC上的EpCAM的生物学并未得到充分了解，并且可能EpCAM抗原在一些CTC中可能是下调或阴性的。在此类情况下，CTC将不由EpCAM铁磁流体捕获，并且在测定法中将导致零CTC。另一种可能性是由它们捕获的CTC由于测定法中使用的细胞角蛋白标记的不存在而无法检测。因此，尽管许多CTC通过目前技术成功地捕获且检测，但在癌症患者的血液中存在无法检测的CTC是可能的，因为它们未能表达在目前测定法中使用的标记。最后，未知TPC和EMT是否在血液中循环并且可以被检测到。然而，目前捕获和检测技术已局限于一种抗原或一类抗原的靶向的事实意指TPC或EMT不可能用目前技术检测到。基于上文，显而易见用于在继发性肿瘤建立前鉴定循环中的这些细胞的方法是高度希望的，特别是在癌症早期。许多实验室和临床程序采用用于从生物样品中分离罕见细胞的生物特异性亲和反应。此类反应通常用于诊断测试中，或用于分离广泛范围的靶物质，尤其是生物学实体例如细胞、蛋白质、细菌、病毒、核酸序列等。基于在目的物质和靶物质与之特异性结合的另一种物质之间的复合物形成，多种方法可用于分析或分离上述靶物质。使复合物与未结合的材料分离可以例如通过偶联到靶物质的细分颗粒或珠的沉降或者通过离心来重力完成。如果需要，此类颗粒或珠可以制备为磁性的，以促进结合/游离分离步骤。磁性颗粒是本领域熟知的，如其在免疫和其它生物特异性亲和反应中的用途一样。参见例如，美国专利号4，554，088和用于临床化学的免疫测定法(Immunoassays for Clinical Chemistry),第 147-162 页，Hunter 等人编辑，爱丁堡的丘吉尔利文斯敦(Churchill Livingston,Edinburgh) (1983)。一般地,促进磁性或重力分离的任何材料都可用于这个目的。然而，已变得明确的是磁分离方法是选择的方法。磁性颗粒可以基于大小分类为大(1.5至约50微米)、小(0.7-1.5微米)或胶体(< 200nm)，所述胶体也称为纳米颗粒。也称为铁磁流体或铁磁流体样材料且具有常规铁磁流体的许多性质的后者在本文中有时被称为胶体、超顺磁颗粒。上述类型的小磁性颗粒在涉及生物特异性亲和反应的分析中是相当有用的，因为它们方便地用生物功能聚合物(例如蛋白质)涂布，提供极高的表面积且给出合理的反应动力学。范围为0.7-1.5微米的磁性颗粒已在专利文献中描述，包括例如美国专利号3，970，518 ;4，018，886 ;4，230，685 ;4，267，234 ;4，452，773 ;4，554，088 ；和 4，659，678 中。这些颗粒中的某些公开为用于免疫学试剂的有用固体载体。如同上文提及的小磁性颗粒，大磁性颗粒(> 1.5微米至50微米)也可以显示出顺磁行为。此类材料一般是由Ugelstad在美国专利号4，654267中描述且由Dynal，(挪威的奥斯陆(Oslo,Norway))制造的那些。Ugelstad过程涉及引起膨胀的聚合物颗粒的合成，并且磁性晶体嵌入膨胀的颗粒中。在相同大小范围中的其它材料通过在分散的磁性晶体的存在下合成聚合物颗粒进行制备。这导致在聚合物基质中磁性晶体的捕获，从而使得所产生的材料磁性。在两种情况下，所产生的颗粒都具有超顺磁行为，所述顺磁行为通过在磁场去除后容易分散的能力表现。与先前提及和在下文进一步详细讨论的磁性胶体或纳米颗粒不同，这些材料以及小磁性颗粒由于磁性材料的质量/颗粒由简单的实验室磁学容易地分离。因此，分离在低至数百高斯/cm到至多约1.5千高斯/cm的梯度中实现。另一方面，由于其分散能量、小磁质量/颗粒和斯托克斯阻力，胶体磁性颗粒(低于约200nm)要求基本上更高的磁性梯度。给予Owen等人的美国专利号4，795，698涉及聚合物涂布的、胶体、顺磁颗粒,所述颗粒通过在聚合物的存在下来自Fe+VFe+3盐的磁石形成产生。给予Molday的美国专利号4，452，773描述了在性质中与Owen等人中所述那些相似的材料，所述材料通过在极高浓度的葡聚糖的存在下经由碱添加由Fe+VFe+3形成磁石和其它氧化铁产生。由两种程序所得到的颗粒显示出对于长达几个月的观察期没有来自含水悬浮液的沉降的合适趋势。如此产生的材料具有胶体性质并且已证明在细胞分离中是非常有用的。Molday技术已通过德国贝尔吉施格拉德巴赫的美天旎生物公司(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)和加拿大温哥华的泰瑞.托马斯公司(Terry Thomas, Vancouver, Canada)商业化。用于生产顺磁、胶体颗粒的另一种方法在美国专利号5，597，531中描述。与Owen等人或Molday专利中所述的颗粒形成对比,这些后面一种颗粒通过将生物功能聚合物直接涂布到预形成的超顺磁晶体上产生，所述预形成的超顺磁晶体已通过大功率声能分散成范围为25至120nm的准稳定的晶状簇。所得到的颗粒在本文中称为直接涂布颗粒，显示出比相同总尺寸的胶体颗粒例如由Molday或Owen等人描述的那些明显更大的磁矩。磁分离技术是已知的，其中将磁场应用于流体介质，以便从流体介质中分离铁磁体。相比之下，与其相对弱的磁应答性结合，胶体、超顺磁颗粒保留在悬浮液中的趋势要求使用高梯度磁分离(HGMS)技术，以便从它们悬浮于其中的无磁性流体介质中分离此类颗粒。在HGMS系统中，磁场的梯度即空间导数对悬浮颗粒的行为施加比在给定点通过场强度施加更大的影响。HGMS系统可以分成两个广泛类别。一个此类类别包括采用磁路的磁分离系统本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：GC劳，MC康奈利，
申请(专利权)人：维里德克斯有限责任公司，
类型：
国别省市：
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