本文描述了用于检测低频率出现的与逆转录酶和/或蛋白酶有关的一种或多种HIV序列变体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从HIV样品群的多种RNA分子中产生cDNA物类；(b)由cDNA物类扩增多种第一扩增子，其中各第一扩增子用能够从HIV分化体产生扩增子的核酸引物对扩增，所述HIV分化体包含分化体A、分化体B、分化体C、分化体D、分化体F和分化体G；(c)克隆扩增第一扩增子的扩增拷贝以产生多种第二扩增子；(d)测定第二扩增子的核酸序列组成；和(e)检测第二扩增子的核酸序列组成中的一种或多种序列变体。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供用于检测和分析与Hiv-1有关的序列变体、特别是HIV分化体A、B、C、D、F和G及其相关重组体的序列变体的方法、试剂和系统。本文所用术语“分化体”总的来讲具有与相关领域普通技术人员所理解的相同含义，是指通常存在于特定地理区域的HIV-1病毒的遗传独特亚群。例如在欧洲，约75%的HIV感染为HIV-B (即分化体B)感染，约25%由HIV-A、HIV-C和其它分化体群组成。变体可包括在平行的靶多核苷酸群体中的单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失变体(称为“indel”)和等位基因频率。本专利技术还涉及通过平行焦磷酸测序研究通过聚合酶链式反应(PCR)复制的核酸以鉴定已知和未知序列的突变和多态性的方法。本专利技术包括使用特别设计的核酸引物，以扩增与特定HIV特性或功能有关的HIV RNA或其互补DNA的特定区和/或一系列重叠区，例如分别与HIV将病毒RNA转录成双链DNA (dsDNA)以备整合至宿主细胞中和适当装配/使病毒多蛋白成熟以产生感染性病毒粒的能力有关的逆转录酶(RT)和蛋白酶(Prot)区。此外，引物的靶位点具有低突变率，使得疑似含有变体(亦称为准种)的靶HIV核酸群中的核酸能够稳定扩增以产生各自的扩增子。以大量平行、有效和有成本效益的方式，对数千独特的HIV扩增子进行测序，以产生扩增子群中存在的序列变体的分布，这使得高于先前所用方法的更大检测灵敏度成为可能。
技术介绍
人免疫缺陷病毒(一般称为HIV)依然是世界范围的主要问题，尽管许多化合物获准用于治疗。由于病毒逆转录酶的易错性质和高病毒周转(找=1-3天)所致，HIV基因组突变得非常快。鉴于在其9.7 Kb基因组复制期间的高突变率，‘准种’的形成导致以动态关系存在的许多不同的突变体。 HIV RT基因编码序列位于pol区的5’端附近，在基因组中两侧是Prot区和RNA酶区——前者具有部分重叠的读框，该读框始于gag基因的p6蛋白的3’端。RT蛋白由440个氨基酸(51 kDa)编码，其主要功能产生于作为异二聚体的组合，所述异二聚体具有由560个氨基酸(66 kDa)编码的RT/RNA酶H多蛋白。它包括3个主要的酶功能:1)使互补DNA链与基因组RNA聚合，2)使亲本RNA链降解，留下由酶的逆转录酶活性产生的互补DNA，和3)产生第一链的第二互补链，从而通过聚合酶活性产生dsDNA原病毒(Lu等，J.Biol.Chem.279 (2004) 54529-54532，其通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的)。对于任何HIV-1病毒基因，引物设计的一个主要困难是因为这种酶的保真度低，这就导致甚至在病毒RNA至dsDNA的单一 RT转化中的高频率突变。文献指出HIV-1RT在单条DNA链聚合期间引起1/2000-1/4000的取代差错频率(substitution errorfrequencies)。由于第一链和第二链相继聚合，因此对于各HIV-1基因组转化，这些出错率可相当于每轮复制共5-10个突变(Preston等,Science 242 (1988) 1168-1171)。这种突变的dsDNA病毒基因组然后整合到宿主生物将要全体复制的染色体中，用于感染并随后整合到其它宿主细胞中。针对逆转录酶功能的药物是减少病毒繁殖的极好靶标，因此，FDA批准了适于以下两种类别的药物:核苷/核苷酸类似物逆转录酶抑制剂(NRTI/NtRTI)和非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)，两者靶向逆转录酶，但却通过不同方式靶向逆转录酶。抗逆转录病毒药物的NRTI类别由RNA和DNA的核苷酸结构单元(buiIdingblock)的结构类似物组成。当整合到病毒DNA中时，这些有缺陷的核苷酸类似物防止与下一个核苷酸形成新的3’ 一5’磷酸二酯键，引起链合成提前终止，并有效地抑制病毒复制(Zapor, M.J.等，Pyschosomatics 45 (2004) 524-535)。NRTI 通常耐受:性良好,但仍可能具有一些难题。在这些难题中有:线粒体毒性(由外周神经病表明(Moyle，G.J.等，Drug Saf 6 (1998) 481-494 ；Simpson, D.Μ.等，J.Acquir.1mmune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.9 (1995) 153-161)、肌病(Gold，R.等，N.Engl.J.Med.323(1990) 994 ；de la Asuncion, J.G.等，J.Clin.1nvest.102 (1998) 4-9)、乳酸性酸中毒(Carr, A.Clin.1nfect.Dis.36，增刊 2 (2003) S96-S100)和外周脂肪营养不良(Carr，Α.等，AIDS 14 (2000) F25-32)、造血系统毒性(表现为贫血、中性粒细胞减少或血小板减少；Gallicchio, V.S.等，Int.J.1mmunopharmaco1.15 (1993) 263-268)、耳毒性(Simdon, J.Clin.1nfect.Dis.32 (2001) 1623-1627)和多种不良的药物相互作用。齐多夫定，通常称为AZT或Retrovir ，是最早获得FDA批准的NRTI药物。这种药物通常与其它抗逆转录病毒药物(例如用于高效抗逆转录病毒治疗(HAART)方案的抗逆转录病毒药物)联合，并且还用来防止病毒由母亲传给儿童。齐多夫定的毒性和副作用与其它NRTI的类似，最见的是血液学毒性。可得到许多其它经批准的核苷类似物药物，但本文仍列举这些核苷类似物药物(齐多夫定是一种胸苷类似物):阿巴卡韦(Ziagen )，一种由GlaxoSmithKline 销售的 鸟苷类似物；去轻肌苷(Videx ),—种由 Bristol Myers Squibb销售的腺苷类似物；以及恩曲他滨(Emtriva ), 一种由Gilead Sciences销售的胞卩密唳类似物。至今唯一经FDA批准的核苷酸RT抑制剂是药物Viread ，亦称富马酸替诺福韦二索罗基酯，一种由Gilead Sciences销售的腺苷5’ -单磷酸类似物。尽管NRTI是竞争结合到HIV基因组中的核苷或核苷酸类似物，但是NNRTI通过与酶直接非竞争地结合而阻断互补DNA延伸。这就影响蛋白质在其活性部位的构象变化，降低对核苷结合的亲和力。NNRTI不需要胞内磷酸化以变得有活性和抑制HIV-1。它们的抗病毒效能和耐受性使NNRTI成为HAART方案的有利组分，且毒性和病毒交叉耐药性不与NRTI重叠(Zapor等，Pyschosomatics 45 (2004) 524-535)。常见的副作用包括轻度皮疹(Scott, L.J.等，Drugs 2 (2000) 373-407)、肝酶水平升高(Dieterich, D.T.等，Clin.1nfect.Dis.38，增刊 2 (2004) S80-89)和脂肪重新分布(Adkins，J.C.等，Drugs 56(1998) 1055-1066)。常用于治疗的NNRTI包括但不限于:依法韦仑(Sustiva /Stocrin )、奈韦拉平(Viramune )和依曲韦林(Intelence )。蛋白酶基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：BB西门，EP圣约翰，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。