阻断试剂及其使用方法技术

本发明专利技术涉及与核酸偶联的非分析物特异性结合蛋白的缀合物在基于探针的检测试验中作为阻断试剂的用途，其中使用包含与核酸结构域偶联的蛋白质分析物结合配偶体的探针检测样品中的分析物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于样品中分析物的基于邻位探针的检测试验(“邻位试验”)，特别涉及该方法的改进以降低复杂的生物样品中出现的非特异性“背景”信号。所述改进包括提供用于该试验的新阻断试剂。设计阻断试剂使其紧密类似(“模拟”)邻位探针的结构。将过量阻断试剂加入样品中以占据该样品中能够非特异性地结合邻位探针的所有或几乎所有结合位点。因此，在本专利技术中，所述阻断试剂的可观察到的效果相当于实现样品的复杂性降低而不显著降低存在于样品中的分析物的浓度或量，从而提高试验的特异性和灵敏度。本专利技术还提供了阻断试剂，包括所述阻断试剂的试剂盒和用于制备所述阻断试剂的方法。邻位试验依赖“邻位探测”的原理，其中通过结合多个(即两个或多个，通常两个或三个)探针来检测分析物，所述的探针当通过结合分析物到达邻位(因此为“邻位探针”)时，使得信号生成。一般地，邻位探针的至少一个包括核酸结构域(或者部分)，所述的核酸结构域(或者部分)连接于该探针的分析物结合结构域(或部分)，并且信号的生成涉及该核酸部分和/或其它探针(或多个探针)携带的另一个功能部分之间的相互作用。因此信号生成依赖探针之间的相互作用(更具体地通过所述的核酸或其所携带的其它功能部分/结构域)，因此所述的信号仅当必要的两个(或多个)探针都结合于分析物时才会出现，从而使检测系统的特异性提高。近年来发展了邻位探测的概念，并且现在基于该原理的许多试验在本领域是熟知的。例如，邻位连接试验(PLA)依赖邻位探针与分析物的邻位结合，从而从连接反应产生信号，所述的连接反应涉及到邻位试验的核酸结构域或者由所述邻位试验的核酸结构域介导(例如，在其之间和/或通过其作为模板)。因此，在邻位试验中可以使用邻位探针，所述的邻位探针结合于分析物并具有核酸结构域或部分，所述核酸结构域或部分在所述分析物结合后以邻位依赖方式相互作用，以形成可检测的、优选可扩增的核酸检测产物，可以借助所述核酸检测产物检测所述分析物，所述的相互作用通常通过连接进行。基于检测试验的邻位探针，特别是邻位连接试验通过将该分析物的存在转化为容易地可检测的或可定量的基于核酸的信号，从而允许灵敏地、快速地和便利地检测或定量样品中的一种或多种分析物，并且能够均质的或异质的形式进行。本领域的邻位探针通常成对地使用，并且分别由对靶分析物具有特异性的分析物结合结构域和与其偶联的功能结构域构成，所述的功能结构域例如为核酸结构域。所述的分析物结合结构域可以是例如核酸“适体”(Fredriksson等人(2002)NatBiotech20:473-477)或可以是蛋白质的，如单克隆或多克隆抗体(Gullberg等人(2004)Proc Natl Acad Sci USAlOl: 8420-8424)。每个邻位探针对的各自的分析物结合结构域可以对分析物上的不同结合位点具有特异性，所述分析物可以由单个的分子或相互作用的分子的复合物构成，或例如在靶分析物作为多聚体存在的情况下可以具有相同的特异性。当邻位探针对彼此紧密相邻时，这主要当两者结合于相同的分析物上的其各自的位点时发生，功能结构域(例如核酸结构域)能够相互作用，例如，核酸结构域通常可以通过连接反应连接，从而形成新的核酸序列，其中所述的新的核酸序列可以被加入反应中的夹板(splint)寡核苷酸作为模板，所述夹板寡核苷酸含有与邻位探针对的各自核酸结构域末端互补的区域。借此生成的新核酸序列用于报告样品中分析物的存在或量，并可以定性地或定量地对其进行检测，例如通过实时、定量PCR (q-PCR)。另外，当邻近时，邻位探针的核酸结构域可以在一个或多个加入的寡核苷酸的相互连接时作为模板而不是彼此连接，所述的相互连接包括使加入的线性寡核苷酸成圆形的分子内连接，例如基于所谓的锁式(padlock)探针原理，其中类似于锁式探针的是，加入的线性寡核苷酸的末端通过杂交至模板而并列，以进行连接，在本文中为邻位探针的核酸结构域(在锁式探针的情况下为探针的靶核酸)。各种该试验的形式描述于W001/61037中。W097/00446和US6，511，809公开了邻位连接试验的不同形式，即首先借助特异性分析物结合试剂将分析物固定于固体基质。相同的邻位连接试验(B卩，在溶液中的)公开于W001/61037、W003/044231、W02005/123963、Fredriksson等人(2002)Nat Biotech20:473_477和Gullberg等人(2004)Proc Natl Acad Sci USAlOl:8420-8424 中。虽然通常使用邻位探针对，但在例如W001/61037和W02005/12963中描述了邻位探针检测试验的改变，其中使用三个邻位探针检测单个分析物分子，第三探针的核酸结构域具有两个游离末端，所述游离末端可以结合(连接)于第一和第二探针的核酸结构域各自的游离末端，从而夹在其间。在该实施方案中，需要两种夹板寡核苷酸对第一和第二探针的每个核酸结构域与第三探针的核酸结构域的连接进行模板化。在W02007/107743描述的其它改变中，为两个邻位探针的核酸结构域的连接作为模板的夹板寡核苷酸携带于第三邻位探针上。不是所有邻位试验均基于 连接。W02007/044903公开了用于检测分析物的基于邻位探针的试验，所述的试验依赖于释放的核酸切割产物的形成和检测。某些描述的实施方案涉及包括分析物结合部分和连接的酶的探针，所述酶作用于连接于第二探针的分析物结合部分的核酸部分，导致释放可检测的核酸切割产物。分析物检测试验，在某些实施方案中包括邻位探针样试剂，其中连接于一个探针的分析物结合部分的聚合酶作用于连接于第二探针的分析物结合部分的核酸部分，如TO2009/012220所描述的。在这些试验中，作为探针对的一个探针的部分的“锚定的(tethered)”聚合酶的作用导致游离在溶液中的模板的生成，所述模板通过加入的聚合酶而易于扩增。与锚定的聚合酶不同，加入的聚合酶仅能够作用于由所述的锚定聚合酶生成的模板，并且不直接作用于探针对的不含聚合酶的探针的核酸部分。根据邻位探测原理，力口入的聚合酶的作用导致所生成模板的扩增，扩增的拷贝是可检测的并指示样品中分析物的存在。除了邻位探针检测试验的变化，还描述了邻位探针自身的结构的变化，例如在W003/044231中使用了多价邻位探针。该多价邻位探针包括至少两个，最多100个分析物结合结构域，所述分析物结合结构域缀合于至少一个，优选地多于一个核酸(或多个核酸)。在许多不同的应用中，已证明基于邻位探针的检测试验，特别是邻位连接试验在特异性和灵敏地检测蛋白，例如弱表达或低丰度蛋白的检测中非常有用。然而，该试验在试验的灵敏度和特异性方面并非没有问题，并且存在改进空间。如上所述的，传统邻位试验，例如邻位连接试验的灵敏度受限于两个主要因素:(i)分析物结合结构域对靶分析物的亲和力和(ii)由未结合的探针特别是探针对的随机邻位产生的非特异性背景信号。使用具有对分析物亲和力高的结合结构域的探针，灵敏度限于检测约6000个分子。习惯上，为了实现低水平的背景，必须使用浓度非常低的邻位探针。这排除了通过使用浓度更高的探针来补偿包含低亲和分析物结合结构域的探针的任何尝试。因此发现这可以限制试验的灵敏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·弗雷德里克松，B·特兰，
申请(专利权)人：欧凌科公司，
类型：
国别省市：