对鳞翅目昆虫具有活性的新苏云金杆菌基因制造技术

本发明专利技术提供从苏云金杆菌菌株获得的编码具有对昆虫害虫（包括鳞翅目昆虫）的杀虫活性的多肽的核酸及其变体和片段。本发明专利技术的具体实施例提供编码杀虫蛋白的分离核酸、包含本发明专利技术实施例的核酸的杀虫组合物、DNA构建体及转化的微生物和植物。这些组合物可在防治害虫特别是植物害虫的方法中使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从编码以昆虫害虫杀虫活性为特征的杀虫多肽的新苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)基因获得的天然和重组核酸。本专利技术的组合物和方法利用所公开的核酸及其编码的杀虫多肽来防治植物害虫。
技术介绍
昆虫是造成全世界农作物损失的主要因素。例如，行军虫取食、黑地蚕损害或者欧洲玉米螟损害可对农业生产商造成经济上的破坏。单单是欧洲玉米螟侵袭非甜质玉米和甜玉米造成的昆虫害虫相关作物损失，一年就达大约十亿美元的损害和防治费用。传统上，影响昆虫害虫群体的主要方法是施用广谱化学杀昆虫剂。但是，消费者和政府监管者都日益关注与合成化学杀虫剂的生产和使用相关的环境危害。由于这些关注，监管者禁止或者限制了一些危害比较大的杀虫剂的使用。因此，人们对于开发另类杀虫剂有很大的兴趣。使用微生物剂如真菌、细菌或者另一种昆虫对具有农业意义的昆虫害虫进行生物防治，提供出具有环境友好性和商业吸引力的合成化学杀虫剂替代方案。一般而言，生物杀虫剂的使用造成的污染和环境危害的风险较低，并且生物杀虫剂能提供比传统广谱化学杀昆虫剂的特征性靶标特异性更高的靶标特异性。另外，生物杀虫剂的生产成本往往较低，因此能提高众多作物的经济产量。已知芽孢杆菌属(Bacillu s)微生物的某些种对于多种昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目害虫以及其他害虫。苏云金杆菌(Bt)和日本金龟芽孢杆菌(Bacillus papilliae)是至今为止发现的最成功的生物控制剂的代表。幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.1entimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)的菌株(Harwook 编辑，((1989) Bacillus (Plenum Press)，306)和腊状芽抱杆菌(B.cereus)的菌株(W096/10083)也被指出具有昆虫病原性。杀虫活性似乎集中在类芽孢结晶蛋白包涵体中，不过从芽孢杆菌的营养生长期也分离到杀虫蛋白。有几种编码这些杀虫蛋白的基因已得到分离和表征(参见例如美国专利N0.5，366，892和5，840, 868)。微生物杀昆虫剂特别是那些从芽孢杆菌菌株获得的微生物杀昆虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。最近，农业科学家通过对作物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白，开发出了抗虫性增强的作物。例如，已对玉米和棉花作物进行遗传工程改造以产生从Bt的菌株分离的杀虫蛋白(参见例如Aronson，(2002)，《细胞分子生命科学》(Cell Mol.Life Sc1.),59(3):417-425 ；Schnepf 等人(1998)，《微生物分子生物学评论》(Microbiol Mol Biol Rev.)，62 (3): 775-806)。这些经遗传工程改造的作物目前在美国农业中广泛应用，给农场主提供了替代传统昆虫防治方法的环境友好的方案。另外，经遗传工程改造而含有杀虫Cry毒素的马铃薯已被出售给美国农场主。虽然这些经遗传工程改造的抗昆虫作物已证明在商业上十分成功，但它们对仅仅少数经济上重要的昆虫害虫具有抗性。因此，仍然需要对昆虫害虫具有更大范围的杀昆虫活性的新Bt毒素，例如对更多种类的鳞翅目昆虫具有活性的毒素。另外，仍然需要对多种昆虫害虫具有活性的生物杀虫剂和需要具有改进的杀昆虫活性的生物杀虫剂。
技术实现思路
本专利技术提供用于影响昆虫害虫的组合物和方法。更具体而言，本专利技术的实施例涉及利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列来产生能表达本专利技术实施例的杀昆虫多肽的转化微生物和植物从而影响昆虫的方法。 在一些实施例中，所述核苷酸序列编码对至少一种属于鳞翅目的昆虫具有杀虫作用的多肽。本专利技术实施例提供编码对昆虫害虫具有杀虫活性的多肽的核酸及其片段和变体(例如SEQ ID N0:1，其编码SEQ ID N0:2)。本专利技术实施例的获自Bt的野生型(例如天然)核苷酸序列编码一种新型杀昆虫肽。本专利技术实施例还提供所公开的核苷酸序列的编码生物活性(例如杀昆虫)多肽的片段和变体。本专利技术实施例还提供由本专利技术实施例的天然或者经修饰的(例如经诱变或者经操纵的)核酸所编码的分离的杀虫(例如杀昆虫)多肽。具体举例，本专利技术实施例的杀虫蛋白包括从经诱变的核酸产生的全长蛋白质和多肽的片段，所述经诱变的核酸被设计用来将特定氨基酸序列引入到本专利技术实施例的多肽中。在具体的实施例中，所述多肽相对于衍生它们的天然多肽的杀虫活性具有增强的杀虫活性。本专利技术实施例的核酸也可用于产生转基因的(例如转化的)单子叶植物或者双子叶植物，所述植物的特征在于其基因组包含至少一个被稳定掺入的核苷酸构建体，所述核苷酸构建体包含本专利技术实施例的编码序列和与其有效连接的驱动所编码的杀虫多肽的表达的启动子。因此，本专利技术还提供转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。在一个具体的实施例中，可使用已被优化以使在宿主植物中的表达提高的核酸来产生转化植物。例如，可将本专利技术实施例的杀虫多肽之一进行反翻译，以产生包含为了在特定宿主中表达而优化的密码子的核酸，所述宿主例如是作物如玉米(Zea mays)作物。这种转化的植物(例如双子叶植物或者单子叶植物)表达编码序列将导致产生杀虫多肽并给植物赋予提高的抗虫性。一些实施例提供表达能在用于影响各种昆虫害虫的方法中使用的杀虫多肽的转基因植物。本专利技术实施例还包括含有本专利技术实施例的杀昆虫多肽的杀虫或者杀昆虫组合物，并可任选包含另外的杀昆虫肽。本专利技术实施例涵盖将这种组合物应用于昆虫害虫的环境以影响昆虫害虫。具体实施例方式本专利技术的实施例涉及用于影响昆虫害虫尤其是植物害虫的组合物和方法。更具体而言，本专利技术实施例的分离核酸及其片段和变体包含编码杀虫多肽(例如蛋白质)的核苷酸序列。所公开的杀虫蛋白对昆虫害虫具有生物活性(例如杀虫活性)，所述昆虫害虫例如但不限于鳞翅目的昆虫害虫。目的昆虫害虫包括但不限于欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)。本专利技术实施例的组合物包含编码杀虫多肽的分离核酸及其片段和变体、包含本专利技术实施例的核苷酸序列的表达盒、分离的杀虫蛋白以及杀虫组合物。一些实施例提供经修饰的杀虫多肽，其特征在于其对鳞翅目昆虫的杀昆虫活性相对于相应的野生型蛋白的杀虫活性而言得到改进。本专利技术实施例还提供用这些新核酸转化的植物和微生物，以及涉及将这种核酸、杀虫组合物、转化的生物体及其产物用于影响昆虫害虫的方法。本专利技术实施例的核酸和核苷酸序列可用于转化任何生物体以产生所编码的杀虫蛋白。本专利技术提供涉及使用这种经转化的生物体来影响或者防治植物害虫的方法。本专利技术实施例的核酸和核苷酸序列也可用于转化细胞器如叶绿体(McBride等人，(1995)，《生物技术》(Biotechnology)，13:362-365 ;以及Kota等人，(1999)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，96:1840-1845)。本专利技术实施例还涉及鉴定天然编码序列的编码生物活性杀虫蛋白的片段和变体。本专利技术实施例的核苷酸序列可 在用于影响害虫特别是昆虫害虫(如鳞翅目害虫)的方法中直接使用。因此，本专利技术实施例提供不依赖使用传统的合成化学杀昆虫剂而影响昆虫害虫的新方法。本专利技术实施例涉及到天然生物可降解杀虫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.19 US 61/375,0591.一种分尚的核酸分子，所述分尚的核酸分子选自: (a)包含SEQID NO:1的核苷酸序列的核酸分子； (b)编码包含SEQID NO: 2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；以及 (c)编码包含以与(b)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性为特征的氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；其中所述％同一性是基于整个序列并且通过GAP版本10分析在默认参数下确定。2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是已被设计用来在植物中表达的合成序列。3.—种DNA构建体，所述DNA构建体包含根据权利要求1所述的核酸分子。4.根据权利要求3所述的DNA构建体，其还包含编码异源多肽的核酸分子。5.—种宿主细胞，所述宿主细胞含有根据权利要求3所述的DNA构建体。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其为细菌细胞。7.根据权利要求5所述的宿主细胞，其为植物细胞。8.—种转基因植物，所述转基因植物包含根据权利要求7所述的宿主细胞。9.根据权利要求8所述的转基因植物，其中所述植物选自玉蜀黍、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、糖用甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜。10.根据权利要求9所述的植物的转化种子，其中所述种子包含所述DNA构建体。11.一种具有杀虫活性的分离的多肽，所述分离的多肽选自: (a)包含SEQID NO:2的氨基酸序列的多肽； (b)由SEQID NO:1的核苷酸序列编码的多肽；以及 (c)与(a)或者(b)的多肽序列具有至少95%序列同一性的多肽；其中所述％同一性是基于整个序列并且通过GAP版本10分析在默认参数下确定。12.根据权利要求11所述的多肽，其还包含异源氨基酸序列。13.—种组合物，所述组合物包含根据权利要求11所述的多肽。14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物选自散剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、喷剂、乳剂、胶体和溶液。15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物通过对苏云金杆菌细胞的培养物进行干燥、冻干、均质、提取、过滤...

【专利技术属性】
技术研发人员：AR阿巴德，H董，SB罗，X施，TC沃尔夫，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：
国别省市：