在脂质体内递送编码免疫原的RNA以用于免疫目的。所述脂质体包含pKa在5.0～7.6范围内的脂质，优选所述脂质具有叔胺。在生理pH下，这些脂质体的表面电荷基本呈中性，并且所述脂质体对免疫有效。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于免疫的RNA非病毒递送领域。
技术介绍
用于免疫动物的核酸递送已成为数年来的目标。人们已经测试了许多方法，包括使用DNA或RNA，使用病毒或非病毒递送载剂(或者甚至无递送载剂，以“裸”疫苗形式)，使用复制型或非复制型载体，或者使用病毒或非病毒载体。核酸疫苗仍需改进和改良。
技术实现思路
如本专利技术所述，以脂质体递送编码免疫原的RNA用来免疫。所述脂质体包含pKa在5.0 7.6范围内的脂质。pKa在该范围内的脂质理想上具有叔胺；此类脂质和具有季胺基团的脂质(如DOTAP或DC-Chol)性质不同。在生理pH下，pKa在5.0 7.6范围内的胺具有中性或减少的表面电荷，而脂质如DOTAP则是强阳离子脂质。本专利技术人发现，由季胺脂质(如D0TAP)形成的脂质体不如由叔胺脂质(如DLinDMA)形成的脂质体适合递送编码免疫原的RNA。因此，本专利技术提供具有包封水性核心的脂质双分子层的脂质体，其中:(i)所述脂质双分子层包含PKa在5.0 7.6范围内的脂质，优选所述脂质具有叔胺；以及(ii)所述水性核心包括编码免疫原的RNA。这些脂质体适用于体内递送RNA至脊椎动物细胞，从而它们可用作药物组合物中的成分用来免疫对象抵抗各种疾病。本专利技术也提供了一种制备包含RNA的脂质体的方法，所述方法包括以下步骤:(a)在低于脂质的PKa但高于4.5的pH下，混合RNA和所述脂质以形成包封所述RNA的脂质体；以及(b)提高所得包含脂质体的混合物的pH，使其高于所述脂质的pKa。脂质体本专利技术应用其中包封有编码免疫原的RNA的脂质体。因而，使RNA (如天然病毒内一样)由脂质体的脂质双分子层与任何外部介质分隔，而且发现以该途径进行包封可保护RNA不被RNA酶消化。所述脂质体可包括一些处在外部RNA(如在脂质体的表面上)，但是至少一半的RNA(理想上为全部)被包封在所述脂质体的核心中。脂质体内的包封不同于例如参考文献I中公开的脂质/RNA复合物。在水性环境中，各种两亲性脂质能形成双分子层以包封含RNA的水性核心，形成脂质体。这些脂质可具有阴离子、阳离子或两性离子亲水性头部基团。本专利技术的脂质体包含pKa在5.0 7.6范围内的脂质，并优选pKa在该范围内的脂质具有叔胺。例如，其可包含1，2~ 二亚油基氧基_N, N- 二甲基_3-氣基丙烧(DLinDMA ；pKa5.8)和/或1，2- 二亚麻基氧基_N, N-二甲基-3-氨基丙烧(DLenDMA)。另一种合适的具有叔胺的脂质是1，2-二油烯基氧基-N，N 二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)。参见图3和参考文献2。也可使用参考文献3中的某些氨基酸脂质，也可使用参考文献4的某些氨基脂质。参考文献5公开了在其头部基团内具有叔胺的其它可用脂质，其完整内容通过引用纳入本文中。本专利技术的脂质体可由单一脂质或脂质混合物形成，条件是所述脂质中的至少一种的pKa在5.0 7.6范围内(并且优选具有叔胺)。在该pKa范围内，优选脂质的pKa是5.5 6.7，例如在5.6和6.8之间，在5.6和6.3之间，在5.6和6.0之间，在5.5和6.2之间，或在5.7和5.9之间。所述pKa是50%的脂质带电时的pH，位于脂质完全带电的点和脂质完全不带电的点的中间。可以用各种方法测量所述pKa，但优选使用下述在标题为“pKa测量”部分中公开的方法测量。通常应测量单一脂质的pKa，而不是测量还包括其它脂质的混合物中的脂质的PKa (例如，不像参考文献6中实施的那样，该方法评判SNALP的pKa而不是单一脂质的pKa)。当本专利技术的脂质体由脂质混合物形成时，优选pKa在所需范围内的那些脂质的比例是脂质总量的20 80%,例如，在30 70%之间，或在40 60%之间。举例来说，在如下所示的可用脂质体中，总 脂质的40%或60%是pKa在所需范围内的脂质。剩余部分可由例如胆固醇(例如35 50%胆固醇)和/或DMG (可选PEG化修饰的DMG)和/或DSPC构成。此类混合物用于下文。这些％值是摩尔百分比。脂质体可包含两亲性脂质，其亲水部分是被PEG化修饰的(即，通过与聚乙二醇共价连接来修饰的)。该修饰可增加所述脂质体的稳定性并防止所述脂质体的非特异性吸附。举例来说，使用诸如参考文献6和7公开的那些技术来使脂质结合PEG。PEG为脂质体提供外层，所述外层可赋予有利的药物代谢动力学特性。RNA (特别是自复制RNA)的有效包封、pKa在5.0 7.6范围内的阳离子脂质、以及PEG化修饰的表面，这三者的结合可实现对于多种细胞类型的有效递送(包括免疫细胞和非免疫细胞)，从而与使用未PEG化修饰的季胺相比，引起更强且更好的免疫应答。可使用不同长度的PEG，例如，在0.5 SkDa之间。用于本专利技术的脂质可以是饱和的或不饱和的脂质。优选使用至少一种不饱和脂质来制备脂质体。图3显不二种可用的不饱和脂质。若不饱和脂质有两条尾，则两条尾都可以是不饱和尾，或者可以有一条饱和尾和一条不饱和尾。实例中使用DSPC、DLinDMA, PEG-DMG和胆固醇的混合物。本专利技术的一个独立方面是含DSPC、DLinDMA、PEG-DMG和胆固醇的脂质体。该脂质体优选包封RNA，如自复制RNA，例如编码免疫原的自复制RNA。脂质体颗粒通常分为3组:多层囊泡(MLV);小单层囊泡(SUV);和大单层囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多个双分子层，形成若干分离的水性隔室。SUV和LUV具有包封水性核心的单一双分子层；通常SUV的直径彡50nm，LUV的直径>50nm。本专利技术的脂质体颗粒理想上是直径在50 220nm范围内的LUV。对于包含不同直径LUV的群体的组合物:(i)在数量上至少80%应具有20 220nm范围内的直径，(ii)所述群体的平均直径(Zav，由强度表示)理想上在40 200nm范围内，和/或(iii)所述直径的多分散性指数应〈0.2。希望参考文献I的脂质体/RNA复合物的直径在600 800nm范围内，且具有高多分散性。所述脂质体大体上可以是球形的。用于制备合适的脂质体的技术是本领域所熟知的，例如参见参考文献8 10。参考文献11描述了一种可用的方法，该方法涉及混合α)脂质的乙醇溶液(ii)核酸的水性溶液和(iii)缓冲液，然后进行混合、平衡、稀释和纯化。优选本专利技术的脂质体可通过该混合工艺获得。混合工艺如上所述，本专利技术提供用于制备包含RNA的脂质体的工艺，所述工艺包括以下步骤:(a)在低于脂质的pKa但高于4.5的pH下混合RNA和所述脂质；然后(b)提高pH，使其闻于所述脂质的pKa。因此，阳离子脂质在步骤(a)的脂质体形成过程中带正电，但之后的pH变化意味着所述正电基团的大多数(或全部)变为中性。该工艺有利于制备本专利技术的脂质体，并且通过在步骤(a)过程中避免pH低于4.5，提高了被包封RNA的稳定性。步骤(a)中的pH高于4.5，理想上高于4.8。采用在5.0 6.0范围内，或在5.0 5.5范围内的pH，能够提供合适的脂质体。在步骤(b)中提高pH，使其高于所述脂质的pKa。理想上提高所述pH至低于9，优选低于8。取决于所述脂质的pKa，步骤(b)中的所述pH由此可提高到6 8的范围内，例如提高至pH6.5±本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·吉尔，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：
国别省市：
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