本发明专利技术涉及中药类水溶性蛋白分子量的检测领域，具体是涉及一种新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法。本发明专利技术新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，运用分子生物学和指纹图谱的原理与技术，将先进的生物技术与指纹图谱新思路相结合，运用SDS-PAGE电泳技术，对新风胶囊中水溶性蛋白成分分析，为今后建立该制剂电泳特征图谱提供依据。通过实验可知，新风胶囊水溶性蛋白共分离出成分深浅不一的35条蛋白带，蛋白质大小在12.5kDa～200kDa范围内均有分布，其中主带有2条，其分子量分别为16.38kDa、17.07kDa左右，这2条主带，可作为新风胶囊水溶性蛋白成分特征指标。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中药类水溶性蛋白分子量的检测领域，具体是涉及一种。
技术介绍
新风胶囊系安徽中医学院第一附属医院的医院制剂(皖药制Z20050062)，该药由黄芪、薏苡仁、雷公藤和蜈蚣4味中药组成，具有益气健脾，化湿通络之功效，具有广阔的开发前景。随着分子生物学的快速发展及应用，为中药的质量控制提供了新的思路。由于中药主要来源于动植物等生物体，其细胞内都含有受遗传基因调控、代表其品种特征性的蛋白质分子，不同蛋白质的分子大小、空间结构和电荷数目上的差异，可以通过电泳得到分离。因此，应用现代分子生物学的原理和方法，将中药制剂质量评价技术从形态、组织、细胞推进到分子水平，对中药制剂中蛋白质成分分析，可以解决目前中药制剂鉴定以及内在质量评价的难题。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供了一种，将SDS-PAGE电泳方法应用于新风胶囊中水溶性蛋白成分测定，为建立该制剂电泳特征图谱提供依据。为了实现上述目的，采用的技术方案如下:，其特征在于，包括如下步骤:①、试剂的配制电极缓冲液，称取甘氨酸5.0g、三羟甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸钠1.0g，力口适量双蒸水溶解后，用lmol/1盐酸调pH至8.3，然后加双蒸水至1000ml，置于4°C保存；固定液，称取三氯醋酸5.0g,加双蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加双蒸水至500ml ；考马斯亮蓝脱色液，量取乙醇400ml、冰醋酸IOOml与双蒸水500ml，混匀；I %琼脂糖溶液，称取琼脂糖0.2g，加电极缓冲液20ml，加热溶解成澄清溶液；10%过硫酸铵溶液,称取过硫酸铵0.“，加Iml双蒸水溶解至澄清；②、供试品溶液的制备取新风胶囊内容物5.0g，于研钵中研成细粉，加6ml IM Tris-HCl缓冲液溶解，研勻，静置5min, 4000r/min离心20min,吸取上清液900 μ I,加300 μ I 4X蛋白质上样缓冲液混合，沸水浴5min，以12000r/min离心20min，冷却后吸取上清液分装，每管分装20 μ 1，-20°C贮存；③、电泳槽的安装电泳槽的各部件在组装前均需清洗干净，选择水平操作台面，首先将白色内芯放入黑色内槽中，然后将电泳玻璃采取凹形玻璃板在白色内芯内侧、矩形玻璃板在白色内芯外侧的方向，顺着白色内芯一侧的胶条小心放入内芯；当两侧的玻璃全部放入到白色内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与黑色内槽密封槽平齐，旋紧紧固旋钮；用移液枪吸取1%琼脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封闭玻璃板，为防止留存气泡，稍抬起一端赶去气泡，琼脂糖溶液需进入胶室0.9 1.1cm,凝固5 7min后进行灌胶操作；④、凝胶的制备按4ml 1.5M Tris-HCl缓冲液、6.7ml 30%丙烯酰胺、1.6ml 1%十二烷基磺酸钠、0.1ml 10%四甲基乙二胺、0.1ml 10%过硫酸铵和3.3ml双蒸水配制12.5%分离胶溶液，然后开始灌胶，并防止气泡产生，水封室温下聚合；待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸取上面的水层，再灌入4.5%浓缩胶溶液，并插上样品梳，4.5%浓缩胶溶液按1.35ml 30%丙烯酰胺、0.9ml I %十二烷基磺酸钠、0.07ml10%四甲基乙二胺、0.07ml 10%过硫酸铵、2.25ml IM Tris-HCl缓冲液和4.33ml双蒸水配制；⑤、上样与电泳待浓缩胶溶液聚合后，双手轻取出梳子，提住白色把手将黑色内槽放入外槽中，用微量注射器吸取样品提取液5μ 1，缓缓注入加样孔中，动作要轻，不能破坏胶面；在黑色内槽内部和外部分别加注电极缓冲液，内部液面高度要高过凹板下沿10mm，外部液面高度为外槽的1/3 ；盖上安全盖，接通电泳仪，80v电压I小时后，待溴酚蓝示踪指示剂前沿到达分离胶上沿时，把电压调至ΙΟΟν，待示踪指示剂行至距琼脂层0.9 1.1cm时，关闭电源，停止电泳，整个电泳过程需要3 4个小时；⑥、染色与脱色电泳结束后，打开电泳槽，取出凝胶，切去浓缩胶，保留分离胶并标记溴酚蓝前沿，置固定液中固定半小时后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温染色1.5 2.5小时；倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝脱色液，确保考马斯亮蓝脱色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温脱色3.5 4.5小时；更换考马斯亮蓝脱色液2 4次，直至蓝色背景全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期，完成脱色后，把凝胶保存在含20%甘油的水中，进行拍照；对拍射照片进行光密度积分值分析；⑦、蛋白质分子量的测定根据样品迁移距离/指示剂迁移距离计算相对迁移率，以标准蛋白质分子量对数对其相对迁移率作标准曲线，根据待测样品相对迁移率查该曲线，计算其分子量。本专利技术，运用分子生物学和指纹图谱的原理与技术，将先进的生物技术与指纹图谱新思路相结合，运用SDS-PAGE电泳技术，对新风胶囊中水溶性蛋白成分分析，为今后建立该制剂电泳特征图谱提供依据。附图说明为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。图1是含Marker的新风胶囊水溶性蛋白SDS-PAGE电泳图。图2是宽分子量标准蛋白曲线。具体实施例方式一、仪器与材料1、仪器SYZ-B型石英亚沸高纯水蒸馏器(江苏金坛市环宇科学仪器厂)。PHS-25型实验室pH计(上海今迈仪器仪表有限公司)。BP211D型十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)。HH-S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)。手动移液器(BIOHIT)。80-2离心沉淀器(上海手术器械厂)。KDC-16H高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)。JY-JX系列垂直电泳槽、JY-C系列电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)。WD-9405B脱色摇床(北京六一仪器厂)。2、材料新风胶囊(由安徽省中医院制剂中心提供，批号:20120112、20111025)。甘氨酸Glycine (Solarbio ;Cat#G8200)。十二烷基磺酸钠SDS (Sigma ;20110105488)。三羟甲基氨基甲烷TRIS(Sigma)。三氯醋酸(天津市光复精细化工研究所；批号:2010.6.17)。琼脂糖(GENECOMPANY LTO ；L0T N0.111860)。IM Tris-HCl 缓冲液(Solarbio ；Cat.N0.T1020 Lot.N0.20110307)。1.5MTris-HCl 缓冲液(Solarbio ；Cat.N0.TlOlO Lot.N0.20110307)。PageRuIer Unstained Protein ladder (Thermo Scientific,赛默飞世尔科技Lot#000961)。4X 蛋白质上样缓冲液(Solarbio ；Cat.N0.P1015 Lot.N0.20110222)。30 % 丙烯酰胺(29: I) (30 % Arc-Bis) (Solarbio ；Cat.N0.AlOlOLot.N0.20101020)。四甲基乙二胺TEMED (Beyot ime ；ST728)。过硫酸铵Ammonium Persulfate (Sigma A6761)。考马斯亮蓝染色液(Beyotime ；P0017B)碧云天生物技术研究本文档来自技高网...
【技术保护点】
新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：①、试剂的配制电极缓冲液，称取甘氨酸5.0g、三羟甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸钠1.0g，加适量双蒸水溶解后，用1mol/l盐酸调pH至8.3，然后加双蒸水至1000ml，置于4℃保存；固定液，称取三氯醋酸5.0g，加双蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加双蒸水至500ml；考马斯亮蓝脱色液，量取乙醇400ml、冰醋酸100ml与双蒸水500ml，混匀；1％琼脂糖溶液，称取琼脂糖0.2g，加电极缓冲液20ml，加热溶解成澄清溶液；10％过硫酸铵溶液，称取过硫酸铵0.1g，加1ml双蒸水溶解至澄清；②、供试品溶液的制备取新风胶囊内容物5.0g，于研钵中研成细粉，加6ml?1M?Tris?HCl缓冲液溶解，研匀，静置5min，4000r/min离心20min，吸取上清液900μl，加300μl?4×蛋白质上样缓冲液混合，沸水浴5min，以12000r/min离心20min，冷却后吸取上清液分装，每管分装20μl，?20℃贮存；③、电泳槽的安装电泳槽的各部件在组装前均需清洗干净，选择水平操作台面，首先将白色内芯放入黑色内槽中，然后将电泳玻璃采取凹形玻璃板在白色内芯内侧、矩形玻璃板在白色内芯外侧的方向，顺着白色内芯一侧的胶条小心放入内芯；当两侧的玻璃全部放入到白色内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与黑色 内槽密封槽平齐，旋紧紧固旋钮；用移液枪吸取1％琼脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封闭玻璃板，为防止留存气泡，稍抬起一端赶去气泡，琼脂糖溶液需进入胶室0.9～1.1cm，凝固5～7min后进行灌胶操作；④、凝胶的制备按4ml?1.5M?Tris?HCl缓冲液、6.7ml?30％丙烯酰胺、1.6ml?1％十二烷基磺酸钠、0.1ml?10％四甲基乙二胺、0.1ml?10％过硫酸铵和3.3ml双蒸水配制12.5％分离胶溶液，然后开始灌胶，并防止气泡产生，水封室温下聚合；待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸取上面的水层，再灌入4.5％浓缩胶溶液，并插上样品梳，4.5％浓缩胶溶液按1.35ml?30％丙烯酰胺、0.9ml?1％十二烷基磺酸钠、0.07ml?10％四甲基乙二胺、0.07ml?10％过硫酸铵、2.25ml?1M?Tris?HCl缓冲液和4.33ml双蒸水配制；⑤、上样与电泳待浓缩胶溶液聚合后，双手轻取出梳子，提住白色把手将黑色内槽放入外槽中，用微量注射器吸取样品提取液5μl，缓缓注入加样孔中，动作要轻，不能破坏胶面；在黑色内槽内部和外部分别加注电极缓冲液，内部液面高度要高过凹板下沿10mm，外部液面高度为外槽的1/3；盖上安全盖，接通电泳仪，80v电压1小时后，待溴酚蓝示踪指示剂前沿到达分离胶上沿时，把电压调至100v，待示踪指示剂行至距琼脂层0.9～1.1cm时，关闭电源，停止电泳，整个电泳过程需要3～4个小时；⑥、染色与脱色电泳结束后，打开电泳槽，取出凝胶，切去浓缩胶，保留分离胶并标记溴 酚蓝前沿，置固定液中固定半小时后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温染色1.5～2.5小时；倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝脱色液，确保考马斯亮蓝脱色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温脱色3.5～4.5小时；更换考马斯亮蓝脱色液2～4次，直至蓝色背景全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期，完成脱色后，把凝胶保存在含20％甘油的水中，进行拍照；对拍射照片进行光密度积分值分析；⑦、蛋白质分子量的测定根据样品迁移距离/指示剂迁移距离计算相对迁移率，以标准蛋白质分子量对数对其相对迁移率作标准曲线，根据待测样品相对迁移率查该曲线，计算其分子量。...
【技术特征摘要】
1.新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，其特征在于，包括如下步骤: ①、试剂的配制 电极缓冲液，称取甘氨酸5.0g、三羟甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸钠1.0g，加适量双蒸水溶解后，用lmol/1盐酸调pH至8.3，然后加双蒸水至1000ml，置于4°C保存； 固定液，称取三氯醋酸5.0g,加双蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加双蒸水至.500ml ； 考马斯亮蓝脱色液，量取乙醇400ml、冰醋酸IOOml与双蒸水500ml，混匀； I %琼脂糖溶液，称取琼脂糖0.2g，加电极缓冲液20ml，加热溶解成澄清溶液； . 10%过硫酸铵溶液,称取过硫酸铵0.1g,加Iml双蒸水溶解至澄清； ②、供试品溶液的制备 取新风胶囊内容物5.0g,于研钵中研成细粉，加6ml IM Tris-HCl缓冲液溶解，研匀，静置5min,4000r/min离心 20min,吸取上清液900 μ I,加300 μ I 4Χ蛋白质上样缓冲液混合，沸水浴5min，以12000r/min离心20min，冷却后吸取上清液分装，每管分装20μ 1，-20°C贮存； ③、电泳槽的安装 电泳槽的各部件在组装前均需清洗干净，选择水平操作台面，首先将白色内芯放入黑色内槽中，然后将电泳玻璃采取凹形玻璃板在白色内芯内侧、矩形玻璃板在白色内芯外侧的方向，顺着白色内芯一侧的胶条小心放入内芯； 当两侧的玻璃全部放入到白色内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与黑色内槽密封槽平齐，旋紧紧固旋钮； 用移液枪吸取I %琼脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封闭玻璃板，为防止留存气泡，稍抬起一端赶去气泡，琼脂糖溶液需进入胶室0.9 1.1cm，凝固5 7min后进行灌胶操作； ④、凝胶的制备 按4ml 1.5M Tris-HCl缓冲液、6.7ml 30 %丙烯酰胺、1.6ml I %十二烷基磺酸钠、.0.1ml 10%四甲基乙二胺、...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘健，孟楣，高家荣，王晓玉，姜辉，
申请(专利权)人：安徽中医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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