本发明专利技术涉及食品安全领域，建立了一种基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法。本发明专利技术方法为：利用显微红外光谱仪采集细菌的红外谱图，进行数据预处理后提取特征中红外波段（3000-2800cm-1、1800-1500cm-1、1500-1200cm-1、1200-800cm-1）的信息，进行主成分分析（Principle?Component?Analysis,PCA）以建立鉴别模型，进行类模拟软独立建模分析（Soft?Independent?Modeling?of?Class?Analogy,SIMCA）以验证模型可靠性。本发明专利技术的优点是：结果可靠，特异性强，检测快速，操作简便，灵敏度高，普及性强，应用范围广；可特异鉴定副溶血弧菌；可检测正常和不同程度损伤状态的副溶血弧菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品安全领域，具体地涉及一种检测副溶血弧菌的方法。
技术介绍
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌,在海产品中的携带率高达45.7%，在我国部分沿海地区，由副溶血弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒事件中居首位。经加热、冷冻、脱水等处理后，细菌或被杀死，或无损的存活下来，还有一些可能受到了亚致死性损伤。在适当条件下，受损细菌可以修复损伤并恢复包括毒力和繁殖能力在内的所有生理活性，仍具有致病性，严重威胁人类健康。因此，检测副溶血弧菌及其亚致死损伤对于食品安全监控和人类健康都具有重要意义。对于细菌的鉴定，常规培养检测方法包括增菌培养、选择性培养、生化试验和血清学反应等过程，耗时长、操作繁琐、检出率低，不适应实际检验工作的需要。以免疫学为基础的检测方法利用抗原抗体反应的显著特异性，包括ELISA、免疫荧光法和放射免疫试验等。基于核酸的检测方法如PCR技术可以在很短时间内将几个甚至一个目标序列扩增到几百万个拷贝，为致病菌检测提供了一种快速、灵敏、特异的检测方法，但对于食品样品中的抑制物质非常敏感，有时会给出假阴性结果。目前已公开的副溶血弧菌检测相关的两个专利包括技术专利“用于检测肠道感染的集合胶体金试纸”(中国专利申请号:201120375786.7)和专利技术专利“PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物、试剂盒和检测方法”(中国专利申请号:201210272737.X)。对于亚致死损伤细菌的检测，现有技术的缺点是:常规培养法工作量大，检测周期长，且可能低估甚至给出假阴性结果；微生物表面形态观察法，则对实验者的操作技能要求较高，且仪器昂贵；基因芯片法价格昂贵，检测时间长，需要专业人员操作等。目前已公开的损伤细菌检测相关的专利仅有专利技术专利“荧光法快速测定活细菌总数”(中国专利申请号:200810140095.1)。红外光谱技术具有操作简单、分析速度快、成本低、应用范围广、灵敏度高等优点，显微红外光谱技术将光学显微镜与红外光谱技术相结合，比普通红外光谱技术更快、更灵敏、更简便。但红外谱图提供的信息较复杂，样品之间差异细微，一般需要结合化学计量学深入分析。红外光谱技术在微生物检测中的应用兴起于上世纪九十年代，目前，国内外尚未见到利用红外光谱技术研究副溶血弧菌亚致死损伤的报道，且大多采用普通红外技术研究细菌。目前未见利用红外光谱技术对副溶血弧菌进行鉴定和不同状态检测的专利。
技术实现思路
鉴于上述现有技术发展情况，本专利技术的目的就是提供一种快速、简便的基于显微红外光谱技术检测副溶血弧菌的方法。本专利技术的目的是这样实现的:首先利用显微红外光谱仪，通过高级功能“Map view”自动采集不同类别细菌或不同状态副溶血弧菌的多张红外谱图，进行二阶导转换等数据预处理。继而对每个菌株的24个样本，分别提取四个特征中红外波段(3000-2800011'1800-1500011'1500-1200011'UOO-SOOcnT1) 二阶导数谱的波数和峰值，进行主成分分析(PCA)，建立每个波段的鉴别模型。最后同样提取四个特征波段二阶导数谱的信息，从每个菌株的24个样本中随机选取14个加入训练集，剩下10个加入预测集，进行类模拟软独立建模(SMCA)分析，预测未知样本，验证每个波段模型的可靠性。通过以上步骤既可以特异鉴定副溶血弧菌，也可以检测正常和不同程度损伤状态的副溶血弧菌。本专利技术所述的基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，包括如下步骤:(I)制备待检样品培养待测菌株，收集菌体，将菌体悬浮于生理盐水中，取菌悬液滴在BaF2盐片上，干燥；(2)光谱采集利用显微红外光谱仪采集细菌的微区域吸收信号，获得原始谱图(map)文件；(3)数据预处理将原始谱图(map)文件转换成红外谱图，并将红外谱图进行二阶导转换；(4)主成分分析(Principle Component Analysis, PCA)提取特征波段二阶导数谱的信息，进行主成分分析(Principle ComponentAnalysis，PCA)建立不同类别或不同状态细菌的鉴别模型；(5)模型验证利用类模拟软独立建模(SoftIndependent Modeling of Class Analogy, SIMCA)预测不同类别或不同状态的细菌，验证模型可靠性。优选地，所述利用类模拟软独立建模(Soft Independent Modeling of ClassAnalogy, SIMCA)预测，是指提取所述特征波段二阶导数谱的信息，将每个菌株的样本随机分为训练集和预测集，对训练集中每一类样本测量数据矩阵，建立主成分回归模型，计算未知样本到各类模型的SIMCA距离，以确定未知样本类别，根据SIMCA结果统计每类样本在每个波段的预测率和拒绝率，验证模型可靠性具体操作如下:(I)制备待检样品将5 μ L溶于生理盐水的菌悬液滴在BaF2盐片(Φ 10 X 2mm)上，均匀铺开，干燥器中放置30min，晾干后上机检测。每块盐片上同时滴5个样品，3孔透射支架同时放置3块盐片，一次可完成15个样品的测试。(2)光谱采集利用高级功能“Map view” 一次自动采集8个微区域的吸收信号，光阑为100 μ mX 100 μ m,步长为100 μ mX 100 μ m,对每个类别或状态的菌株均准备3份平行样品，共获得3个map文件。采集参数为:扫描范围ΜΟΟΟ-ΘΟΟαιΓ1 ;采集时间:3s，即16张干涉图加和；分辨率AcnT1。 (3)数据预处理将每个原始map文件转换成8张红外谱图，选取4000-800(^1波段进行大气背景抑制、自动基线校正、归一化(使酰胺谱带I1655CHT1的吸收强度等于1)，采用Savitzky-Golay模式，平滑点数为7，多项式次数为3，将谱图进行二阶导转换。(4) PCA 分析提取以下四个中红外特征波段二阶导数谱的波数和峰值，分别进行后续的PCA分析和 SMCA 分析:3000-2800cm_1U800-1500cm_1U500-1200cm_1U200-800cm_1o 对每个菌株的24个样本，分别提取上述四个特征波段二阶导数谱的信息，进行PCA分析。PCA属于无监督的分类方法，可将多维的数据压缩成几个主要、独立的潜在变量(主成分，PC)，这些主成分保存了最相关和最具代表性的信息。PCl表示能描述目标多维数据矩阵中最显著的特性，PC2表示除PCl之外的所能描述目标多维数据矩阵中最显著的特性。二维PCA示意图可直观区分不同类别或不同状态的细菌，从而建立每一个波段的鉴别模型。(5) SIMCA 分析验证对每个菌株的24个样本，分别提取步骤(4)中四个特征波段二阶导数谱的信息，从每个菌株的24个样本中随机选取14个加入训练集，剩下10个加入预测集；对训练集中每一类样本测量·数据矩阵，建立主成分回归模型；计算未知样本到各类模型的SMCA距离，以确定未知样本类别；根据SIMCA结果统计每类样本在每个波段的预测率和拒绝率，考察模型可靠性。本专利技术利用显微红外光谱仪采集不同类别或状态的细菌谱图(均为纯培养物)，对原始数据进行一系列预处理后，结合化学计量学中的PCA和SMCA，可特异鉴定副溶血弧菌，也可以检测正常本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，包括以下步骤：（1）制备待检样品培养待测菌株，收集菌体，将菌体悬浮于生理盐水中，取菌悬液滴在BaF2盐片上，干燥；（2）光谱采集利用显微红外光谱仪采集菌株的微区域吸收信号，获得原始图谱文件；（3）数据预处理将原始图谱文件转换成红外谱图，并将红外谱图进行二阶导转换；（4）主成分分析提取特征波段二阶导数谱的信息，进行主成分分析建立不同类别或不同状态细菌的鉴别模型；（5）模型验证利用类模拟软独立建模预测不同类别或不同状态的细菌，验证模型可靠性。
【技术特征摘要】
1.一种基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，包括以下步骤: (1)制备待检样品 培养待测菌株，收集菌体，将菌体悬浮于生理盐水中，取菌悬液滴在BaF2盐片上，干燥； (2)光谱采集 利用显微红外光谱仪采集菌株的微区域吸收信号，获得原始图谱文件； (3)数据预处理 将原始图谱文件转换成红外谱图，并将红外谱图进行二阶导转换； (4)主成分分析 提取特征波段二阶导数谱的信息，进行主成分分析建立不同类别或不同状态细菌的鉴别丰旲型; (5)模型验证 利用类模拟软独立建模预测不同类别或不同状态的细菌，验证模型可靠性。2.根据权利要求1所述的基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述的副溶血弧菌为纯培养物。3.根据权利要求1所述的 基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，利用显微红外光谱仪采集菌株的红外谱图，是指利用显微红外光谱仪自动采集微区域的吸收信号，光阑为100 μ mX 100 μ m，步长为100 μ mX 100 μ m，采集参数为:扫描范围，4000-6000^1 ;采集时间，3s ;分辨率，8CHT1。4.根据权利要求3所述的基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述步骤(2)中一次自动采集8个微区域的吸收信号，对每个待测菌株均准备3份平行样品，进行检测。5.根据权利要求1所述的基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述步骤(3)中， 所述将原始图谱文件转...
【专利技术属性】
技术研发人员：史贤明，喻文娟，施春雷，侯静文，王瑞斌，朱邦尚，王大鹏，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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