一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，首先在HEK-293细胞表面表达了带有His6-tag标签的嗅觉受体蛋白ODR-10，并提取出来将其利用适配体有效地固定在石英晶体微天平表面构建成嗅觉受体传感器；通过测试一系列确定浓度气味物质丁二酮，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量标准曲线；然后测试未知浓度待测气体，根据石英晶体微天平谐振频率的改变量和丁二酮浓度-谐振频率改变量标准曲线得到待测气体中气味物质丁二酮的浓度。本发明专利技术方法所需仪器简单、操作方便，解决了敏感元件嗅觉受体蛋白ODR-10与石英晶体微天平的稳定耦合，实现了快速、特异地检测气味物质丁二酮。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测技术，尤其涉及。
技术介绍
生物嗅觉系统能够快速、灵敏地感受并分辨出空气中的气味物质，这得益于嗅觉受体能够与空气中气味分子特异性地结合。传统气体传感器设计中，敏感材料多采用导电聚合物、高分子材料等，缺点是特异性差。气味分子种类繁多，多是结构各异的小分子量挥发性有机气体，尤其当检测环境中的空气中含有多种气味时，特异性地检测某种气味变得相对困难。新兴的生物传感器拟从仿生的角度解决这一问题，模仿生物嗅觉系统利用嗅觉受体对气味分子的特异性识别，为特异性检测气体提供了新的技术途径。因此，如何获得高度特异的气体敏感材料，并将其与二级传感器的有效稳定耦合，实现气味分子的特异性检测是目前气体传感器进一步发展亟需解决的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用嗅觉受体蛋白作为敏感材料结合石英晶体微天平构建嗅觉受体传感器进行气体特异性检测的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的:，该方法包括以下步骤: (1)制备嗅觉受体蛋白0DR-10；(2)固定嗅觉受体蛋白0DR-10在石英晶体微天平表面构建嗅觉受体传感器； (3)将洁净空气以lmL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态后，再将浓度确定的含有气味物质丁二酮的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为嗅觉受体传感器对此浓度下的气体物质丁二酮的响应值；最后再将洁净空气泵入检测腔内，清洗检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔IOmin后，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定后可泵入另一浓度待测气体到检测腔进行下一次检测；重复上述步骤，得到一系列浓度的气体物质丁二酮引起的传感器谐振频率改变量，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线； (4)对于未知浓度的气体物质丁二酮的检测，首先将洁净空气以lmL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态Ftl后，再将浓度未知的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定到F1后，得到谐振频率改变量F1- Ftl，根据上述步骤得到的丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线推算出待测气体物质丁二酮的浓度，实现对丁二酮的浓度测定。进一步地，所述步骤(I)包括以下子步骤: (1.1)构建表达载体:首先采用基因工程技术对含有嗅觉受体蛋白0DR-10基因和rho-tag信号妝序列全长cDNA饱攝MtPEGFP-Nl/rho-tag/odr-10 (其基因序列如SEQ IDN0.1所示)进行适当改造，构建适用于嗅觉受体传感器使用的嗅觉受体蛋白的表达载体，使其N末端带有融合表达的His6-tag标签；首先，设计相应的引物，获取和扩增嗅觉受体蛋白ODR-1O基因和rho-tag信号肽序列全长cDNA，并在N末端添加融合表达的His6_tag标签，上游引物序列SEQ ID N0.2 ;下游引物序列如SEQ ID N0.3所示；聚合酶链式反应(PCR)在50 μ L 反应体系中进行，包括 I μ L PEGFP-Nl/rho-tag/odr-lOJ^ML, I μ L 上游引物，I μ L 下游引物，4 μ L浓度为IOmM的dNTP混合物，0.5 μ L高保真聚合酶STAR (Takara,日本)，10 μ L PCR缓冲液(含Mg2+)和32.5 μ L去离子水，温度循环首先是95°C预变性3分钟，接着进行30循环的94°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸70秒，最后是10°C降温10秒。扩增后获得的产物通过限制性内切酶的双酶切反应亚克隆到表达M(AtpcDNA3.1(+)的多克隆位点命I琳BernH /之间，完成嗅觉受体蛋白的表达载体pcDNA3.1 (+)/his6-tag/rho-tag/odr-W的构建,其基因序列如SEQ ID N0.4通过测序进行鉴定; (1.2)转染人胚胎肾细胞HEK-293:HEK_293细胞培养液为添加了体积百分比为10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μ g/mL)的DMEM高糖培养基，培养条件为37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱。转染之前一天，HEK-293细胞被接种于六孔培养皿中，每孔接种500 μ L浓度为0.5 2Χ IO5 cells/mL的细胞，在不含抗生素的DMEM高糖培养基里生长至融合度约为80-90%，待转染；转染试剂为Iipofectamin 2000，使用步骤1.1构建好的表达载体制J.1 (+)/his6-tag/rho-tag/odr-10转染HEK-293细胞；用无血清DMEM培养液把4 μ g表达载体稀释至50 μ L，混匀；再用无血清DMEM培养液稀释10 μ L的脂质体转染试剂Iipfectamin 2000至50 μ L，在室温下孵育5分钟；接着把稀释后的表达载体和Iipfectamin 2000混合至总体积为100 μ L,摇匀，室温孵育20分钟；六孔板的每个孔中加入100 μ L表达载体和Iipfectamin 2000的混合液，前后摇板混匀后，在37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱孵育24-48小时后，嗅觉受体蛋白即表达在HEK-293细胞膜表面，以备用作嗅觉受体传感器的敏感材料； (1.3)提取嗅觉受体蛋白0DR-10:为将步骤1.2中制备的嗅觉受体蛋白0DR-10用作嗅觉受体传感器的敏感材料，使用膜蛋白提取试剂盒从转染后的HEK-293细胞中提取嗅觉受体蛋白0DR-10 ;先收集转染48小时的HEK-293细胞，用4°C的去离子水离心洗3次，每次5分钟；然后加入ImL蛋白提取缓冲液、I μ L蛋白酶抑制剂、I μ L DDT，超声破碎4次，然后40C 14000g离心10分钟，弃沉淀，上清液转至一新的离心管中水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，下层含有细胞膜蛋白；取下层样品，加入500yL 4°C灭菌水，4°C放置5分钟，然后37°C水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，重复此步骤5次；最终得到的下层样品即为膜蛋白混合物，其中包含带有融合His6-tag标签的嗅觉受体蛋白0DR-10 ;-70°C保存待用。所述步骤(2)具体为:本专利技术的嗅觉受体传感器制备过程如下:将石英晶体微天平置于乙醇中浸泡10分钟,氮气干燥；然后IM NaOH水溶液中浸泡20分钟,去离子水清洗；IM HCl溶液中浸泡5分钟；新配置的浓H2SO4与H2O2 (体积比2:3)混合液浸泡I分钟，氮气干燥，以完成石英晶体微天平的彻底清洁；利用金巯键自组装反应在石英晶体微天平的金电极上共价固定一层可以特异性识别融合表达的His6-tag标签的巯基化单链DNA适配体，该适配体由5’末端共价修饰 了 HS-(CH2)6基团的SEQ ID N0.5所示的基因序列组成，室温下反应21小时；然后封闭分子(Il-MUA)封闭石英晶体微天平传感器的金电极表面未反应的位点，封闭条件为室温下I小时；把步骤1.5制备的含有嗅觉受体蛋白的细胞膜蛋白混合液均匀孵育在石英晶体微天平传感器的金电极表面，并放在室温孵育过夜，使嗅觉受体蛋白通过融合表达的His6-tag本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）制备嗅觉受体蛋白ODR?10；（2）固定嗅觉受体蛋白ODR?10在石英晶体微天平表面构建嗅觉受体传感器；（3）将洁净空气以1mL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态后，再将浓度确定的含有气味物质丁二酮的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为嗅觉受体传感器对此浓度下的气体物质丁二酮的响应值；最后再将洁净空气泵入检测腔内，清洗气体检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔10min后，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定后可泵入另一浓度待测气体到检测腔进行下一次检测；重复上述步骤，得到一系列浓度的气体物质丁二酮引起的传感器谐振频率改变量，得到丁二酮浓度?谐振频率改变量曲线；（4）对于未知浓度的气体物质丁二酮的检测，首先将洁净空气以1mL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态F0后，再将浓度未知的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定到F1后，得到谐振频率改变量F1??F0，根据上述步骤3得到的丁二酮浓度?谐振频率改变量曲线获得待测气体物质丁二酮的浓度，实现对丁二酮的浓度测定。...

【技术特征摘要】
1.一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (O制备嗅觉受体蛋白ODR-1O ； (2)固定嗅觉受体蛋白0DR-10在石英晶体微天平表面构建嗅觉受体传感器； (3)将洁净空气以lmL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态后，再将浓度确定的含有气味物质丁二酮的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为嗅觉受体传感器对此浓度下的气体物质丁二酮的响应值；最后再将洁净空气泵入检测腔内，清洗气体检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔IOmin后，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定后可泵入另一浓度待测气体到检测腔进行下一次检测；重复上述步骤，得到一系列浓度的气体物质丁二酮引起的传感器谐振频率改变量，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线； (4)对于未知浓度的气体物质丁二酮的检测，首先将洁净空气以lmL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态Ftl后，再将浓度未知的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定到F1后，得到谐振频率改变量F1- Ftl，根据上述步骤3得到的丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线获得待测气体物质丁二酮的浓度，实现对丁二酮的浓度测定。2.根据权利要求1所述一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，其特征在于，所述步骤I包括以下子步骤: (1.0构建表达载体:首先采用基因工程技术对含有嗅觉受体蛋白0DR-10基因和rho-tag信号妝序列全长cDNA饱质MlPEGFP-Nl/rho-tag/odr-ΙΟ (其基因序列如SEQ IDN0.1所示)进行适当改造，构建适用于嗅觉受体传感器使用的嗅觉受体蛋白的表达载体，使其N末端带有融合表达的His6-tag标签；首先，设计相应的引物，获取和扩增嗅觉受体蛋白0DR-10基因和rho-tag信号肽序列全长cDNA，并在N末端添加融合表达的His6_tag标签，上游引物序列SEQ ID N0.2 ;下游引物序列如SEQ ID N0.3所示；聚合酶链式反应在50 μ L反应体系中进行，温度循环首先是95°C预变性3分钟，接着进行30循环的94°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸70秒，最后是10°C降温10秒；扩增后获得的产物rho-tag/odr-10通过限制性内切酶的双酶切反应亚克隆到表达载体pcDNA3.1 (+)的多克隆位点Kpn I和BernH /之间，完成嗅觉受体蛋白的表达载体pciWA .1 (+)/his6~tag/rho-tag/odr-10的构建，其基因序列如SEQ ID N0.4通过测序进行鉴定； (1.2)转染人胚胎肾细胞HEK-293:HEK_293细胞培养液为添加了体积百分比为10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μ g/mL)的DMEM高糖培养基，培养条件为37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱；转染之前一天，HEK-293细胞被接种于六孔培养皿中，每孔...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜立萍，吴春生，邹玲，王平，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：