本发明专利技术表达H9亚型禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus）血凝素蛋白的重组新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus)rLX/H9HA，保藏号为CGMCCNo：6652。本发明专利技术是利用已建立的NDV弱毒LX株的反向遗传操作平台，将H9N2亚型AIV流行株?A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012的HA基因插入LX株基因组全长转录载体pLX中，得到含有H9N2亚型AIVHA基因的重组新城疫病毒基因组全长cDNA克隆pLX-H9HA。经转染获得的重组病毒rLX/H9HA在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，连续传多代仍能稳定表达HA蛋白，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及应用反向遗传技术，拯救一株以新城疫病毒为载体表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株rLX/H9HA，用于研制疫苗。
技术介绍
反向遗传操作技术(Reversegenetics manipulation technique)是指将 RNA病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在体外通过采用基因突变、基因插入、基因敲除、基因置换等方法人为构建新的具有感染性的病毒，以研究病毒的基因组结构及功能和病毒宿主之间的相互作用等，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。解决了 RNA病毒基因组难以操作这一难题，同时为新型疫苗的研发提供了新的思路。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是单股、不分节段的负链RNA病毒，属于副粘病毒科成员。按照标准的致病性指标可以将病毒分为速发型(强毒)、中发型(中等毒力)和缓发型(弱毒)。基因组长度大约15kb，其结构为3’ -1eader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次编码6种结构蛋白:核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein, NP)、磷蛋白(Phosphoprotein, P)、基质蛋白(Matrix protein, Μ)、融合蛋白(Fusion protein, F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidaseprotein,HN)和大分子蛋白(Largeprotein, L)。 禽流感病毒(AvianInfluenza Virus,AIV)是禽流感(Avian influenza, A I)的病原体，分类上属于正黏病毒科(Orthomyxovoridae) ,A型流感病毒属。病毒基因组由8个单股负链的RNA片段组成，各自编码功能性蛋白，分别为PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS基因。一般呈球形，直径80nnTl20nm，有囊膜，囊膜表面主要有2种糖蛋白纤突，即血凝素(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA),迄今已发现16种HA亚型和9种NA亚型。禽流感病毒对宿主的致病性是由多个基因决定的，其中HA基因及其编码的蛋白尤为重要，在病毒吸附及穿膜过程中起着关键作用，是重要的表面抗原，它刺激机体产生中和抗体，可中和病毒的感染。H9N2亚型禽流感病毒是危害当前养禽业的重要病原之一，广泛存在于家禽中，虽然表现为低致病性，但具有一些独有的发病特点，主要表现为高感染率、高发病率、低死亡率，多引起雏鸡和育成鸡的隐性感染和产蛋鸡的产蛋下降且产蛋率难以恢复，对养禽业造成了严重的危害，并具有重要的公共卫生意义。疫苗接种是防制新城疫和禽流感这两种疾病的主要有效手段。同灭活苗相比，活载体疫苗具有用量少、成本低、省时省力、免疫保护时间长等优点，可达到一针防多病的目的。载体病毒最重要的一个特点是能被用来迅速研制出针对新发高致病性传染病的基因工程疫苗。NDV除具备这一特点外，还具有遗传稳定性好、不存在与细胞基因组整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性强等诸多优点，可作为疫苗载体.Journal of Virology, 2006, 80 (21): 10293-10306.] 在 NDV 基因组内插入禽流感病毒HA基因后的重组病毒，可在动物体内复制并稳定持续地表达HA蛋白，用此重组病毒作为疫苗，可以诱导机体产生针对Al和ND的双重免疫保护力.Proc Natl Acad SciUSA, 2006, 103(21):8197-8202.Schroer Dj Veits Jj Grund C，et al.Vaccination withNewcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highlypathogenic H7 avian influenza virus.Avian Dis，2009，53 (2):190-197.]。2004年刘晓文等从LBM的健康鸭群中分离到具有高滴度生长特性的NDV毒株LX(遗传进化上属于ClassII基因I型)，并成功构建其全长克隆pLX.中国动物传染病学报.2010, 18 (6): 22-26.]。2012年，古小兵等于常州武进分离到一株具有代表性的H9N2亚型 AIV 流行毒株 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012，其 HA 效价为 Illog2, EID5tl 为 9.17，热稳定，具有很好的抗原性。因此，本专利技术以PLX为骨架，构建可表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株，用于应对 当前H9亚型禽流感和新城疫的流行。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种以新城疫病毒为载体表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株，用于制造疫苗。本专利技术新城疫病毒(NewcastleDisease Virus) rLX/H9HA,保藏号为 CGMCC No:6652。本专利技术新城疫病毒rLX/H9HA用于表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的应用。本专利技术利用已建立的鸭源新城疫病毒LX株的反向遗传操作平台，将H9N2亚型AIVWJ57株的HA基因ORF插入NDV全长转录载体pLX，构建出重组质粒pLX_H9HA，该重组质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后，获得了具有较高繁殖性能的表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组疫苗株rLX/H9HA，适合疫苗的大规模生产。本专利技术的第二个目的在于提供一种表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组新城疫疫苗株rLX/H9HA的构建方法，是以NDV弱毒LX株的基因组全长转录载体pLX为骨架，将H9亚型AIV流行株A/Chicken/JiangSu/WJ57/2012的HA基因的开放阅读框插入转录载体PLX的？、1基因之间，经反向遗传技术获得重组病毒1*1^/!19撤。具体包括以下步骤:1.全长克隆pLX-H9HA的构建I) H9N2亚型禽流感病毒WJ57株HA基因的分段克隆构建阳性质粒pmWJl和pmWJ2:以WJ57株病毒的cDNA为模板，设计两对引物分两段扩增HA基因0RF，即WJl:1 1067nt、WJ2:1068 1683nt，分别克隆获得阳性质粒pmWJl和pmffJ202) pmWJl与NDVLX株P基因融合克隆的构建以LX株基因组cDNA为模板扩增其2350_3141nt，以pmWJl为模板扩增HA基因ORF的fl067nt，通过Overlap PCR将二者融合在一起并克隆得到质粒pPWJl。3) pmffJ2与NDVLX株M基因融合克隆的构建分别以阳性质粒pmWJ2和LX株基因组cDNA为模板PCR扩增H9HA基因ORF的1068 1683nt和LX株基因组3142 3635nt，Overlap PCR将二者融合在一起，克隆得到阳性质粒pWJ2M。4)全长克隆pLX- H9HA的获得质粒pPWJl与pWJ2M同时用Aar I和Spe I进行双酶切，回收目的片段并连接，构建质粒pPWJM ;用Sac II和Avr II对质粒pPWJM进行双酶切后替换pLX的对应序列，构建出重组NDV基因组全长克隆pLX-H9HA，具体的构建模本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株新城疫病毒(Newcastle?Disease?Virus)?rLX/H9HA，保藏号为CGMCC?No：6652。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀梵，丁平云，陈雨昕，刘晓文，胡顺林，王晓泉，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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