一种白桦高效转基因方法，涉及一种植物转基因的方法。该方法是要解决现有白桦转基因方法转化效率低，脱菌过程复杂的问题。该方法按以下步骤进行：一、将继代培养的无根苗两次生根培养，选取适用于农杆菌侵染的健壮叶片；二、农杆菌侵染；三、共培养；四、通过愈伤培养、分化培养、继代培养和生根培养，最终获得转基因植株。该方法通过选择适宜生理状态的外植体，大大增强了叶片抵抗农杆菌感染的能力、加速伤口侵染几率，脱菌次数由原来的20～25次减少到7～10次，白桦转基因效率提高了2.32～3倍。该方法可应用于白桦转基因领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物转基因的方法。
技术介绍
白桦(Betula platyphylla Suk.)是东北地区珍贵阔叶树种之一,但由于白桦育种周期长，遗传改良进程缓慢，传统的白桦育种技术不能按照育种目标设计改造性状，满足日益增长的社会需求。因此，开展白桦基因工程育种研究势在必行。目前，现有的白桦转基因技术选用的外植体叶片过于幼嫩或者衰老，幼嫩叶片容易被侵染的农杆菌感染，需要每天或隔天进行外植体脱菌，这种被感染的叶片不易获得转化细胞；衰老叶片虽然不容易被农杆菌感染，但叶片分化愈伤组织能力差，也不易获得转化细胞。上述原因导致传统的白桦转基因方法转化过程复杂、转化效率低的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有白桦转基因方法转化过程复杂、转化效率低的问题，提供。本专利技术的按以下步骤进行:—、选取高度为I 1.5cm继代培养的白桦无根苗,在生根培养基中培养24 26天，去除根部再次移入生根培养基中继续培养30 35天，选取苗高为5 6cm白桦植株的第2或第3片叶片基部的0.2 0.3cm处叶片组织，用于农杆菌的侵染；二、将步骤一中叶片浸入农杆菌菌液中侵染，其中菌液OD6tltl为0.1，侵染时间为3 5min，将侵染后的叶片放置在无菌滤`纸上吸去附着的菌液，更换滤纸再次吸取菌液；三、将步骤二中浸染后的叶片近轴面向下接种在愈伤诱导培养基上，在温度为25°C的黑暗条件下进行共培养，培养至第二天，用无菌吸水纸擦拭叶片表面的农杆菌，再将叶片移入新的愈伤诱导培养基中继续共培养，每天脱菌I次，3 4d结束共培养；四、将步骤三中共培养的叶片转接至含选择剂和抑菌剂的愈伤诱导培养基上，25°C光照条件下进行选择培养，15d后在切口处可见抗性愈伤组织形成，将抗性愈伤组织切下转接到含选择剂和抑菌剂的分化培养基中，15 20d后产生抗性不定芽，将抗性芽转接到含选择剂和抑菌剂的继代培养基中，待不定芽长到I 1.5cm时，转接到含选择剂和抑菌剂的生根培养基上进行生根培养，15d后长出不定根，即获得转基因株系；其中步骤一中所述的生根培养基包含WPM培养基和浓度为0.2 0.4mg/L的IBA ；步骤三中所述的愈伤诱导培养基包含WPM培养基、浓度为0.8 1.2mg/L的6-BA和浓度为0.02 0.06mg/L的NAA ;步骤四中所述的含选择剂和抑菌剂的愈伤诱导培养基包含WPM培养基、浓度为0.8 1.2mg/L的6-BA、浓度为0.02 0.06mg/L的NAA、选择剂及抑菌剂，所述的含选择剂和抑菌剂的分化培养基包含WPM培养基、浓度为0.8 1.2mg/L的6-BA、浓度为0.02 0.06mg/L的NAA、浓度为0.4 0.5mg/L的GA3、选择剂及抑菌剂，所述的含选择剂和抑菌剂的继代培养基包含WPM培养基、浓度为0.8 1.0mg/L的6-BA、选择剂及抑菌齐IJ，所述的含选择剂和抑菌剂生根培养基包含WPM培养基和浓度为0.2 0.4mg/L的IBA及选择剂，其中所述的抑菌剂为浓度为250 300mg/L的头孢霉素或浓度为250 300mg/L 的 Timentin。本专利技术所述的选择剂是与转入农杆菌中质粒的抗生素相对应的，可能的选择剂为浓度为40 50mg/L的卡那霉素、浓度为3 5mg/L的G418或浓度为5 8mg/L潮霉素等。本专利技术包含以下有益效果:该方法通过选择适宜生理状态的外植体，大大增强了叶片抵抗农杆菌感染的能力、加速了伤口的侵染机率，脱菌次数由原来的20 25次减少到7 10次，白桦转基因效率提高了 2.32 3倍。附图说明图1为实施例一中继代培养的白桦外植体；图2为实施例一中第一次生根培养的外植体；图3为实施例一中第二次生根培养35天的外植体；图4为实施例一中转基因白桦叶片的选择培养；图5为实施例一中获得的转基因抗性愈伤组织；图6为实施例一中愈伤组织形成的抗性不定芽。具体实施方式 本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一:本实施方式的按以下步骤进行:一、选取高度为I 1.5cm继代培养的白桦无根苗，在生根培养基中培养24 26天，去除根部再次移入生根培养基中继续培养30 35天，选取苗高为5 6cm白桦植株的第2或第3片叶片基部的0.2 0.3cm处叶片组织，用于农杆菌的侵染；二、将步骤一中叶片浸入农杆菌菌液中侵染，其中菌液OD6c 为0.1，侵染时间为3 5min，将侵染后的叶片放置在无菌滤纸上吸去附着的菌液，更换滤纸再次吸取菌液；三、将步骤二中浸染后的叶片近轴面向下接种在愈伤诱导培养基上，在温度为25°C的黑暗条件下进行共培养，培养至第二天，用无菌吸水纸擦拭叶片表面的农杆菌，再将叶片移入新的愈伤诱导培养基中继续共培养，每天脱菌I次，3 4d结束共培养；四、将步骤三中共培养的叶片转接至含选择剂和抑菌剂的愈伤诱导培养基上，25°C光照条件下进行选择培养，15d后在切口处可见抗性愈伤组织形成，将抗性愈伤组织切下转接到含选择剂和抑菌剂的分化培养基中，15 20d后产生抗性不定芽，将抗性芽转接到含选择剂和抑菌剂的继代培养基中，待不定芽长到I 1.5cm时，转接到含选择剂和抑菌剂的生根培养基上进行生根培养，15d后长出不定根，即获得转基因株系；其中步骤一中所述的生根培养基包含WPM培养基和浓度为0.2 0.4mg/L的IBA ；步骤三中所述的愈伤诱导培养基包含WPM培养基、浓度为0.8 1.2mg/L的6-BA和浓度为0.02 0.06mg/L的NAA ;步骤四中所述的含选择剂和抑菌剂的愈伤诱导培养基包含WPM培养基、浓度为0.8 1.2mg/L的6-BA、浓度为0.02 0.06mg/L的NAA、选择剂及抑菌剂，所述的含选择剂和抑菌剂的分化培养基包含WPM培养基、浓度为0.8 1.2mg/L的6-BA、浓度为0.02 0.06mg/L的NAA、浓度为0.4 0.5mg/L的GA3、选择剂及抑菌剂，所述的含选择剂和抑菌剂的继代培养基包含WPM培养基、浓度为0.8 1.0mg/L的6-BA、选择剂及抑菌齐IJ，所述的含选择剂和抑菌剂生根培养基包含WPM培养基和浓度为0.2 0.4mg/L的IBA及选择剂，其中所述的抑菌剂为浓度为250 300mg/L的头孢霉素或浓度为250 300mg/L 的 Timentin0本实施方式所述的选择剂是与转入农杆菌中质粒的抗生素相对应的，可能的选择剂为浓度为40 50mg/L的卡那霉素、浓度为3 5mg/L G418或浓度为5 8mg/L潮霉素坐寸o具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤一中生根培养基包含WPM培养基和浓度为0.4mg/L的IBA。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤一中用于农杆菌侵染的叶片组织为第2或第3片健壮叶片基部的0.3cm处叶片。其它与具体实施方式一或二相同。具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:步骤三中愈伤诱导培养基包含WPM培养基、浓度为0.8mg/L的6-BA和浓度为0.02mg/L的NAA。其它与具体实施方式一至三之一相同。具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是:步骤四中含选择剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种白桦高效转基因方法，其特征在于上述方法按以下步骤进行：一、选取高度为1～1.5cm继代培养的白桦无根苗，在生根培养基中培养24～26天，去除根部再次移入生根培养基中继续培养30～35天，选取苗高为5～6cm白桦植株的第2或第3片叶片基部的0.2～0.3cm处叶片组织，用于农杆菌的侵染；二、将步骤一中叶片组织浸入农杆菌菌液中侵染，其中菌液OD600为0.1，侵染时间为3～5min，将侵染后的叶片放置在无菌滤纸上吸去附着的菌液，更换滤纸再次吸取菌液；三、将步骤二中浸染后的叶片近轴面向下接种在愈伤诱导培养基上，在温度为25℃的黑暗条件下进行共培养，培养至第二天，用无菌吸水纸擦拭叶片表面的农杆菌，再将叶片移入新的愈伤诱导培养基中继续共培养，每天脱菌1次，3～4d结束共培养；四、将步骤三中共培养的叶片转接至含选择剂和抑菌剂的愈伤诱导培养基上，25℃光照条件下进行选择培养，15d后在切口处可见抗性愈伤组织形成，将抗性愈伤组织切下转接到含选择剂和抑菌剂的分化培养基中，15～20d后产生抗性不定芽，将抗性芽转接到含选择剂和抑菌剂的继代培养基中，待不定芽长到1～1.5cm时，转接到含选择剂和抑菌剂的生根培养基上进行生根培养，15d后长出不定根，即获得转基因株系；其中步骤一中所述的生根培养基包含WPM培养基和浓度为0.2～0.4mg/L的IBA；步骤三中所述的愈伤诱导培养基包含WPM培养基、浓度为0.8～1.2mg/L的6?BA和浓度为0.02～0.06mg/L的NAA；步骤四中所述的含选择剂和抑菌剂的愈伤诱导培养基包含WPM培养基、浓度为0.8～1.2mg/L的6?BA、浓度为0.02～0.06mg/L的NAA、选择剂及抑菌剂，所述的含选择剂和抑菌剂的分化培养基包含WPM培养基、浓度为0.8～1.2mg/L的6?BA、浓度为0.02～0.06mg/L的NAA、浓度为0.4～0.5mg/L的GA3、选择剂及抑菌剂，所述的含选择剂和抑菌剂的继代培养基包含WPM培养基、浓度为0.8～1.0mg/L的6?BA、选择剂及抑菌剂，所述的含选择剂和抑菌剂生根培养基包含WPM培养基和浓度为0.2～0.4mg/L的IBA及选择剂，其中所述的抑菌剂为浓度为250～300mg/L的头孢霉素或浓度为250～300mg/L的Timentin。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜静，杨光，韦睿，刘桂丰，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：
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