一种抗菌重组多肽及其表达载体，解决了现有的通过人工合成蛋白肽的方法合成的Lactoferampin（Lfcin）和Lactoferampin（Lfampin）的一种嵌合结构肽链（N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N）存在的生产工艺繁琐，成本昂贵，产量低，不适合规模化生产问题。该抗菌重组多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO:2所示。本发明专利技术具有抑菌效果强，生产工艺简单，成本低，产量高，适合规模化生产的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种抗菌重组多肽及其表达载体。
技术介绍
1928年，英国细菌学家弗莱明发现了青霉素，从此拉开了人类使用抗生素的序幕。抗生素自使用以来，虽然挽救了无数生命，但是抗生素具有一定的毒副作用，长期不规范使用很容易使菌、毒株产生抗药性，同时使机体免疫功能受到抑制，世界卫生组织建议抗生素在医院内使用率不超过30%，而中国却高达74%。近年来，抗生素不仅在疾病防治中大量使用，在食品、卫生保健品和动物饲料等方面也无限制使用，致使抗生素的使用效果逐年下降，一些抗药的超级病菌、抗药病毒不断涌现，给疾病防治带来极大困难，严重损害了人以及动物的健康。目前，亚洲和欧洲都成为了耐药性细菌的高发地区，而在我国三级医院中，耐药性细菌基本上是比较常见，发生率在30% 40%，甚至50%，从世卫组织了解到，在中国诊断为结核病的病例当中，有6.8%为耐药结核，远远高于大多数发达国家2%的比例，据统计资料显示，我国每年有8万人死于过度使用抗生素，7岁以下儿童因不合理使用抗生素造成耳聋的数量高达30万人。在动物疾病防治方面，仅以奶牛乳房炎为例，我国奶牛乳房炎呈阳性率为46.4% 85.7%，发病率为20% 70%，抗生素一直是治疗奶牛乳房炎的重要手段，自从1945年试用青霉素治疗奶牛乳房炎以来，因其疗效显著而使抗生素治疗奶牛乳房炎得到了不断的发展，但是，长期大量使用抗 生素不仅导致耐药性细菌的产生，治疗效果降低，同时抗生素还使奶牛免疫功能受到抑制，容易造成重复感染，更严重的是，耐药性细菌还可以通过乳汁传染给人，牛奶中残留的抗生素也会诱发人体产生超敏反应。人类正面临失去这些宝贵药物的危险，而失去这些药物的速度已经超过替代药物的开发速度，世界将进入所谓的后抗生素时代，在合理使用抗生素的同时，研制安全、高效、不易产生抗药性的新型药物替代和辅助传统抗生素成为新一代药物研究的必然要求。乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是一种铁结合性糖蛋白，主要存在于哺乳动物的各种外分泌物中，以乳汁特别是初乳中含量最高，具有广谱的抗菌功能，抗菌机理有别于抗生素，不易产生抗药性，应用前景及市场潜力广阔，越来越受到国内及国外科研工作者的关注，但是乳铁蛋白不能单独作为抗菌药物使用，如何增强其抗菌活性成为目前研究的热点。Bolscher等通过人工合成蛋白肽的方法合成了 Lactoferampin (Lfcin)和Lactoferampin (Lfampin)的一种嵌合结构肽链(N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N),测得该种肽抗菌活性显著高于Lactoferampin和Lactoferampin,甚至两者混合物。合成方法是:采用Mill1-Gen 9050肽链合成仪，从赖氨酸(Lys)开始先合成LFcinl7-30肽链，到N端的苯丙氨酸(Phe)结束，再通过肼解作用将C末端赖氨酸(Lys)上的保护集团(ivDde)释放,继续合成LFampin265-284肽链,通过这个方法合成的肽链含有一个C末端赖氨酸氨基化合物，两个含N末端的肽链在C末端两侧，采用RP-HPLC进行纯化，收集到的肽采用离子肼质谱(LCQ Deca XP)进行分析检验。现有技术的缺点:生产工艺繁琐，成本昂贵，产量低，不适合规模化生产。
技术实现思路
为了解决现有的通过人工合成蛋白肽的方法合成的Lactoferampin (Lfcin)和Lactoferampin (Lfampin)的一种嵌合结构肽链(N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N)存在的生产工艺繁琐，成本昂贵，产量低，不适合规模化生产问题，本专利技术提供一种抗菌重组多肽及其表达载体。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下:一种抗菌重组多肽，该抗菌重组多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。所述抗菌重组多肽的表达量为0.23mg/ml 2.3mg/ml。的一种抗菌重组多肽的基因表达载体，该基因表达载体通过以下方法得到:合成抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc基因，将该基因与pGEM-T Easy Vector连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞，筛选阳性克隆测序，将序列正确的抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc基因与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体PPIC9K通过T4DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞，筛选阳性克隆，经酶切筛选出正确连接的重组质粒pPIC9K-Lfa-AA-Lfc。所述重组质粒pPIC9K-Lfa-AA_Lfc经过线性化后，转化到巴斯德毕赤酵母菌中表达，表达产物层析法纯化。所述巴斯德毕赤酵母为毕赤酵母宿主菌GS115。本专利技术的有益效果是:乳铁蛋白分子中的两个抗菌活性部分Lactoferampin (Lfcin)和Lactoferampin(Lfampin)均位于分子的相似区域N端,本专利技术根据Lfcin和Lfampin两个肽段在乳铁蛋白中的二级结构和空间排列状态，利用生物软件设计出抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc的氨基酸序列，并且合成了该抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc的基因序列，通过真核表达系统制备出一种具有热稳定、抗菌作用广谱、药效期长、相对分子质量小的新型抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc，同时，由于乳铁蛋白抗菌机理的特殊性，使得该抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc具有不易产生抗药性的优点，为新型抗菌药物的研制打下坚实基础，经检测抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc的表达量为0.23mg^2.3mg/ml，并且表达产物在培养基上清液中，因此可以推断，这种廉价、简便、高效的制备方法为抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc的产业化生产提供了条件，在实验室条件下摇瓶培养就可以获得较高产量(表达量为0.23mg/mL)，不仅成本低廉，而且生产工艺简单，适合规模化生产，有利于工业规模的分离和下游加工。抗菌试验发现表达后的抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc对细菌6个属中的大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、坏死梭杆菌、停乳链球菌、鸡白痢沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌等菌株均有抗菌活性，初步说明该表达后的抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc的抗菌广谱。经肌肉注射途径对绵羊给药，通过血浆抑菌试验发现注射后20分钟至试验结束的7个小时内，血浆对停乳链球菌有较强的抗菌效果，表明肌肉注射给药吸收效果良好，被机体吸收后的抗菌活性稳定。本专利技术中所设计的基因也可以克隆到原核表达系统中表达生产；也可利用蛋白质合成方法制备本专利技术中所设计的多肽。附图说明图1 为乳铁蛋白(lactoferrin, LF)的结构不意图及 Lactoferampin (Lfcin)和Lactoferampin (Lfampin)位置分布不意图；图 2 中图 2A 为 Lactoferampin (Lfcin)和 Lactoferampin (Lfampin)在乳铁蛋白(lactoferrin,LF)中的位置分布不意图，图 2B 为 Lactoferampin(Lfcin)和 Lactoferampin(Lfampin)的一种嵌合结构肽链(N-FKCRRWQWRMKKLG-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗菌重组多肽，其特征在于，该抗菌重组多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗菌重组多肽，其特征在于，该抗菌重组多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。2.根据权利要求1所述的一种抗菌重组多肽，其特征在于，所述抗菌重组多肽的表达量为 0.23mg/ml 2.3mg/ml。3.如权利要求1所述的一种抗菌重组多肽的基因表达载体，其特征在于，该基因表达载体通过以下方法得到:合成抗菌重组多肽Lfa-AA-Lfc基因，将该基因与pGEM-T EasyVector连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞，筛选阳性克隆测序，将...
【专利技术属性】
技术研发人员：苗青青，
申请(专利权)人：苗青青，
类型：发明
国别省市：
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