本发明专利技术公开了一种极耐热糖苷酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达与应用，该极耐热糖苷酶基因的DNA序列SEQ?NO：1通过密码子的替换和诱导条件的改变，实现了该酶在大肠杆菌中可溶性表达，酶活达到13U/mL，该糖苷酶具有极强的耐热性能和特异性降解人参皂苷Rb1为Rd的能力，该酶在90℃、pH4.8的条件下酶活最高，在温度70-100℃、pH4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L，该酶1U/mL在90℃、pH5.2、5％甲醇条件下30min可将99％人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd，该极耐热糖苷酶性质优异，可应用于苷元类物质的酶法转化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程及生物质利用
，尤其涉及。
技术介绍
人参Panax ginseng是亚洲传统的名贵中药材,具有生物活性广泛,药理作用独特等特点，但其化学成分复杂。随着分析技术的革新，人参主要的化学成分得到了进一步的明确。研究发现，人参皂苷是人参主要的生物活性物质，到目前为止，已经分离鉴定40余种人参皂苷单体，其中5种主要皂苷(人参皂苷Rbl、Rb2、Re和Rgl)占总皂苷的80%以上，其它的阜苷(Rd、Rg3、Rh2和Compound K等)含量很低,称为稀有阜苷(Applied MicrobiologyandBiotechnology，2012，94:673-682)。由于对单体进行生物活性研究，易于阐明其确切的药理作用，发现活性较强的化合物，因此越来越多的学者对人参皂苷单体进行了生理功能的研究。人参皂苷Rd药理作用广泛，有些药理作用与其它人参皂苷类似，但是Rd具有许多独特的药理作用，如保护心脑血管、清楚自由基、促进T细胞增殖、提高天然杀伤细胞(NK)活性、保护神经系统等药理作用(中草药2009，40 (5):832-836)。但是，由于人参皂苷Rd在人参属植物中含量很低，而且结构复杂，化学合成至今还没有成功，目前只能通过从人参等药用植物中提取，但其成本太高，从而限制了 Rd的进一步研究和应用。而主要皂苷Rbl和Re与Rd的差别仅仅是多一个葡萄糖基或者阿拉伯糖基，因此通过对人参皂苷Rbl和Re转化得到Rd是可行的方法。对于人参皂苷Rbl的转化，有化学转化法和生物转化法。化学转化法因其反应剧烈、选择性差、副产物多等缺点而不被采用。生物转化具有反应条件温和，特异性好等特点，而受到青睐。目前人参皂苷Rbl生物转化生产Rd主要有微生物转化法和酶转化法，主要存在以下缺点:(I)大多数微生物或酶都来源于常温，温度稳定性差；(2)高浓度的底物对转化有抑制作用；(3)产物葡萄糖对转化的酶有抑制作用；(4)转化的专一性不强；(5)转化周期长；(6)生产成本过高。Kim等从70多株好氧菌中筛选到12株菌可以将人参皂苷Rbl转化成人参皂苷Rd，底物浓度为0.47g/L ;而能将人参皂苷Rbl较完全转化的3株细菌，均有其它皂苷的副产物(The Journal of Micobiology，2005，43:456-462)。吕国忠等人发现一种人参内生灰绿梨头霉菌能专一性的转化Rbl成人参皂苷Rd，但转化周期较长，且转化率不高(中国专利技术专利，专利公开号:CN 102080048 A)。因此，寻找高效、低成本的生物酶转化人参皂苷Rbl生产人参皂苷Rd具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用，旨在解决目前无法提供用于人参皂苷Rbl生产 人参皂苷Rd的高效、低成本生物酶的问题。本专利技术的目的在于提供一种极耐热糖苷酶基因，该极耐热糖苷酶基因的DNA序列如SEQ NO:1所示。进一步，该极耐热糖苷酶基因的获取过程为:参照NCBI上已发表的T.thermarum DSM 5069极耐热糖苷酶的基因序列设计引物，登录号:YP 004660190.1，以提取的T.thermarum DSM 5069基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得极耐热糖苷酶基因全序列。进一步，该极耐热糖苷酶基因克隆到pET_28a载体，可得到包含极耐热糖苷酶基因核苷酸序列的重组质粒pET-28a-bgl。进一步，所述重组质粒pET-28a-bgl的制备方法为:步骤一，以Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到极耐热糖苷酶基因的PCR扩增产物，引物为:Pl:CCCCCATGGGTTTTCCAAAGGATTTTCT Gl TCGG CC, CG AGCk TGGCG^TiX AAGTTGAAATGGGATATG,下划线表示Nco I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；P2: CCCCTCGAGCAT OC6CCAGkT]T CGTA TG G GCTT TT CA GGTAGTTGTGAAAGlGCCGTTGTCCCTTCTTTG,下划线表示Xho I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；步骤二，将步骤一所得PCR扩增产物和pET_28a分别用Nco I和Xho I双酶切，并分别割胶回收，16°C过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET_28a_bgl。进一步，极耐热糖苷酶的可溶性表达的实现方法为:将重组质粒pET-28a_bgl转化大肠杆菌JM109 (DE3)，挑单菌落到摇瓶培养基，培养和诱导的温度为37°C，不加入诱导剂IPTG，12h后收集细胞，超声波破细胞，并利用Ni亲和层析柱进行重组酶的纯化，最终得到极耐糖苷酶的纯酶。进一步，极耐热糖苷酶的定性为:在95°C、pH 4.8的条件下酶活最高，该酶在温度70-100°C、pH 4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L。进一步，极耐热糖苷酶在转化人参皂苷Rb I为Rd中的应用。进一步，该极耐热糖苷酶应用于对人参皂苷Rbl的转化时，该酶lU/mL在90°C、pH5.2、5%甲醇条件下30min，可将99%人参皂苷Rbl转化为Rd。本专利技术公开了一种极耐热糖苷酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达与应用，该极耐热糖苷酶基因的DNA序列如SEQ NO:1所示，通过密码子的替换和诱导条件的改变，实现了该酶在大肠杆菌中可溶性表达，酶活达到13U/mL，该糖苷酶具有极强的耐热性能和特异性降解人参皂苷Rbl为Rd的能力，该酶在90°C、pH 4.8的条件下酶活最高，在温度70-100°C、pH 4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L，该酶lU/mL在90°C、pH 5.2、5%甲醇条件下30min可将99%人参皂苷Rbl转化为人参皂苷Rd，本专利技术提供的极耐热糖苷酶性质优异， 可应用于人参皂苷酶法转化。附图说明图1是本专利技术实施例提供的极耐热糖苷酶可溶性表达的SDS-PAGE蛋白电泳图，I为蛋白 marker ;2，5，8，11，14，17 为全细胞蛋白；3，6，9，12，15，18 为沉淀蛋白；4，7，10，13，16，19为可溶性蛋白；图2是本专利技术实施例提供的极耐糖苷酶纯蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳图，I为蛋白marker ;2为大肠杆菌JM109(DE3)的全细胞蛋白；3为大肠杆菌JM109 (DE3)带重组质粒pET-28a-bgl的全细胞蛋白；4为极耐热糖苷酶的纯酶；图3是本专利技术实施例提供的温度和pH对极耐热糖苷酶活性的影响；图4是本专利技术实施例提供的极耐热糖苷酶对人参皂苷Rbl的转化薄层图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定专利技术。 本专利技术的目的在于提供一种极耐热糖苷酶基因，该极耐热糖苷酶基因的DNA序列如SEQ NO:1所示。在本专利技术实施例中，该极耐热糖苷酶基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种极耐热糖苷酶基因，其特征在于，该极耐热糖苷酶基因的获取过程为：参照NCBI上已发表的T.thermarum?DSM?5069极耐热糖苷酶的基因序列设计引物，登录号：YP_004660190.1，以提取的T.thermarum?DSM?5069基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得极耐热糖苷酶基因全序列；该极耐热糖苷酶基因克隆到pET?28a载体，可得到包含极耐热糖苷酶基因核苷酸序列的重组质粒pET?28a?bgl。
【技术特征摘要】
1.一种极耐热糖苷酶基因，其特征在于，该极耐热糖苷酶基因的获取过程为:参照NCBI上已发表的T.thermarum DSM 5069极耐热糖苷酶的基因序列设计引物，登录号:YP_004660190.1，以提取的T.thermarum DSM 5069基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得极耐热糖苷酶基因全序列； 该极耐热糖苷酶基因克隆到pET-28a载体，可得到包含极耐热糖苷酶基因核苷酸序列的重组质粒pET-28a_bgl。2.如权利要求1所述的极耐热糖苷酶基因，其特征在于，所述重组质粒pET-28a-bgl的制备方法为: 步骤一，以Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到极耐热糖苷酶基因的PCR扩增产物，引物为:Pl:CCCCCATGGGTTTTCCAAAGGATTTTCT Gl TCGG CG AGCk TGGC CoG CT T O: AAGTTGAAATGGGATATG，下划线表示Nco I，斜体加粗表示优势密码子替换的位占.P2:CCCCTCGAGCAT OC OC CACGTA TG G GCTl TT CA GGTAGTTGTG AAAOCG/GCCGTTGTCCCTTCTTTG,下划线表示Xho I，斜...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵林果，裴建军，曹福亮，王飞，汪贵斌，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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