人工合成抗蚜虫基因ASGNA及其合成方法和应用技术

一种人工合成抗蚜虫基因ASGNA，它包含有17个核苷酸的5’非翻译区、21个核苷酸的3’非翻译区和一个长度为474bp开放读码框。其合成方法将雪花莲凝集素基因序列中的122位A改为T，290位G改为T，299位G改为A，350位A改为T，365位T改为C，434位G改为T，470位A改为T，482位G改为T，得到抗蚜虫基因ASGNA的核苷酸序列。人工合成抗蚜虫基因ASGNA在转化拟南芥获得抗蚜虫转基因植物中的应用。构建成的连接有抗蚜虫基因ASGNA的表达载体，转到拟南芥中表达，经过在转基因拟南芥上蚜虫生长以及趋避实验，结果表明，对蚜虫的平均抑制率为44%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及人工合成的抗蚜虫基因-ASGNA序列及编码的氨基酸序列。
技术介绍
蚜虫等某些刺吸式和咀嚼式同翅目的害虫是农业上极为重要的害虫之一，它们靠吸取植物汁液为食，不仅对农作物造成了严重的危害，而且还承担了植物病毒传播的优良媒介。如:2000年至2003年，我国河南省爆发了严重的植物病毒，多种作物受到侵袭，经济损失巨大，其中，蚜虫在病毒的传播中起了主导的作用。使用化学杀虫剂虽然可以在短时间内迅速杀死害虫，但是相继而来也产生了一系列的问题，例如污染环境、破坏生态平衡、杀死蚜虫天敌、危害人类健康，而且化学杀虫剂也极易使蚜虫产生抗性。植物抗蚜基因工程的研究为有效控制蚜虫的危害开辟了新的途径。常见的抗蚜基因主要分为两大类，一类是特异性抗蚜基因，如来源于大豆的Rag基因、从野生型莴苣中获得的Nr基因、来源于甜瓜中的Vat基因以及SdI基因和Mi基因等，这些抗蚜基因只针对特异的蚜虫种 类有一定的作用。另一类是广谱性抗蚜基因，常见的有三大类:细胞分裂素基因、蛋白酶抑制剂基因和植物凝集素基因。该类抗蚜基因对蚜虫的作用范围广泛，没有专一性，其中植物凝集基因是迄今为止在抗蚜基因工程中研究的最为深入，对蚜虫的生长发育和繁殖能力有明显抑制作用的基因。植物凝集素(Lectin)是Stillmark于1888年首次在蓖麻籽萃取物中发现的,广泛存在于植物中，尤其在种子和营养器官中含量丰富。是一类具有特异性糖结合活性的天然植物蛋白，具有一个或多个可与单糖或寡糖特异的可逆结合的非催化结构域。雪花莲凝集素(Galanthus nivalis Agglutinin, GNA)是目前与害虫治理有关且研究的比较多的一种单子叶植物甘露糖结合凝集素。由四个相同的亚基组成的四聚体，富含Leu，Asn和Glu，并含有4个氨基酸残基。成熟的GNA是由4个分子量为12，500Da的单体组成的4聚体蛋白，含有12个甘露糖专一结合位点。每个单体具有3个相同的结合甘露糖位点，通过SDS-PAGE及蔗糖梯度离心证明了 GNA的三维结构是由3个反向平行，4个β折叠通过Ω环相连组成的一个β桶。该凝集素对同翅目刺吸式口器的害虫有明显的抑制作用。当植物受到害虫的侵袭时，GNA从受害的植物细胞释放到害虫的消化道中，引发害虫产生毒性，完成其防御功能。在植物未受到侵袭时该凝集素不表现活性。与大多数的凝集素相比，雪花莲凝集素不会对人畜和蚜虫的天敌产生毒害，因此，在植物基因工程中有着很好的应用前景。Down等人(1996)证实了 GNA不仅能抑制马铃薯蚜虫的存活率，而且能抑制其繁殖率，在含0.1%浓度GNA的人工喂养条件下，马铃薯蚜虫的存活率下降了 10%，繁殖率减少了 65%，存活的虫体大小与对照相比也下降了 40%。用过表达GNA的马铃薯进行试验，结果表明，当GNA的表达量占可溶性蛋白的0.3%-0.4%时，转基因植株对蚜虫的抑制率与人工喂养的实验结果一致，没有明显变化。但用含0.05%GNA的饲料喂养甘蔗蛴螬幼虫，结果表明，21天后幼虫生长受到抑制，28天后幼虫死亡率明显上升(Allsopp等，Entomologta Expertmentaliset Applwata80:409-414, 1996)。目前转GNA的抗蚜小麦(徐琼芳等，麦类作物学报，2005, 25(3):7-10)，抗蚜水稻(Nagadhara 等，Theor Appl Genet, 2004，109:1399-1405)，抗虫牙大白菜(杨广东等，园艺学报，2003, 30(3):341-342),抗虫牙烟草(Hider等，TransgenicReserach, 1995, (4): 18-25)等都表现出对蚜虫有抑制作用。对于GNA的杀虫机理目前已有一些初步的研究报道:Zhu等指出植物凝集素能结合到害虫消化道上皮细胞糖蛋白受体上，对害虫产生局部或系统毒害效果，从而抑制其生长，甚至将其杀死；有研究表明在褐飞虱的血淋巴中出现了 GNA，说明GNA可以穿透中肠细胞壁进入循环系统，引起中毒反应。Du等研究发现GNA在褐飞虱的中肠中与400kd的铁蛋白受体相结合，破坏了寄主体内的铁平衡。另外，王庆军等证明了它还可在害虫的消化道内诱发病灶，促进消化道中细菌的繁殖，对害虫本身造成危害，抑制害虫生长、发育及繁殖。但是，在先前的报道中，表达GNA的转基因植株只能对蚜口密度产生50%的抑制率，并不能对所有蚜虫产生抑制作用，所以，GNA的蚜虫抑制率有待进一步提高。袁正强等人(2001，植物学报)对GNA基因进行了改造和转基因烟草抗蚜虫实验，结果表明蚜虫抑制率提高到了 70%。此外，来源于雪 花莲的植物凝集素基因虽然有较好的抗蚜性，但该基因在单子叶植物中高效表达，适合于单子叶植物转基因抗虫研究，而天然的GNA转入双子叶植物中，该基因表达量低，达不到预期的抗蚜效果，因此需要对天然GNA进行修饰改造，以使其适合拟南芥、棉花等双子叶植物的转基因应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服上述现有技术的缺点，提供一种适合双子叶植物-拟南芥的人工合成抗蚜虫基因ASGNA。本专利技术所要解决的另一个技术问题在于提供一种人工合成抗蚜虫基因ASGNA的方法。本专利技术所要解决的还有一个技术问题在于为抗蚜虫基因ASGNA提供一种用途。解决上述技术问题所采用的技术方案是:抗蚜虫基因ASGNA包含有17个核苷酸的5’非翻译区、21个核苷酸的3’非翻译区和一个长度为474bp开放读码框，其核苷酸序列如下:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCOGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTOGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCT(XOiTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTOXiCTACTGGAACTCACACOGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATTAAGCTTGTGACTGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTT抗蚜虫基因ASGNA的合成方法包括下述步骤:1、合成抗蚜虫基因ASGNA(I)合成抗蚜虫基因ASGNA雪花莲凝集素基因LEC GNA2 (基因序列号为GenBank:M55556.1)的序列如下:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工合成抗蚜虫基因ASGNA，其特征在于它包含有17个核苷酸的5’非翻译区、21个核苷酸的3’非翻译区和一个长度为474bp开放读码框，其核苷酸序列如下：?CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCG?CCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTT?TGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAA?GTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACG?TGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCT?GCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCAT?CTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATT?ACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTG?ATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCAT?CTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATTAAGCTTGTGA?CTGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTT。...

【技术特征摘要】
1.一种人工合成抗蚜虫基因ASGNA，其特征在于它包含有17个核苷酸的5’非翻译区、21个核苷酸的3’非翻译区和一个长度为474bp开放读码框，其核苷酸序列如下:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATTAAGCTTGTGACTGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTO2.—种权利要求1抗蚜虫基因ASGNA的合成方法，其特征在于它包括下述步骤: (I)合成抗蚜虫基因ASGNA 基因序列号为GenBank:M55556.1的雪花莲凝集素基因LEC GNA2的序列如下:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACAGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCGAACAAACCGATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTACAGAAGGATAGGAATGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCGCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATAAAGCTTGTGACGGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTGCATGTATGTGGGAAGAGTAATAAAATAAGTGCATTTGAGATAATCGACCTCGTCGCG 将雪花莲凝集素基因序列中的122位A改为T，290位G改为T，299位G改为A，350位A改为T，365位T改为C，434位G改为T，470位A改为T，482位G改为T，得到抗蚜虫基因ASGNA的核苷酸序列，根据此序列设计如下12条引物:Pl:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTP2:TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTP3:CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTAP4:TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTP5:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAP6:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATP7:AAATTGGTTTGTTAGATGGGTTGTACACCACGAGGTTCCCATCAGTCTGCATGCTGAP8:ATGCACACGTAATTCCCATTTTGGCCTCCAGTGTTGCTTGCCCAAATTGGTTTGTTAGAP9:AACGATCAGTTCCGTAGATCACAACGTTCCTATCCTTCTGAAGGATGCACACGTAATPIO:AGATGCGGGAATTCCAACAAGTCCGGTGTGAGTTCCAGTAGCCCAACGATCAGTTCCGTPll:AAGCTTAATCTTTCCAGCAGTAGGATATTTCTCTGAGGGTGGAGATGCGGGAATTCCAP12:AAGTTAAAAGATCACCGGTCATTACTTTGCAGTCACAAGCTTAATCTTTCCAGCA全长的抗蚜虫基因ASGNA按下述方法连接合成: 将 10 μ mo I/μ L 的P6 上游引物与 10 μ mol/μ L 的 Ρ7 下游引物、Primer STAR HS DNAPolymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为 1: 1:10:8 加入PCR管中，72°C延伸 40min,得到长度为97bp如下的核苷酸片段:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTT 用质量浓度为1%的琼脂 糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P5引物为上游引物、P8引物为下游引物，取IOOng/μ L的模板、10 μ mol/μ L的Ρ5引物、10 μ mol/μ L的Ρ8引物，Primer STAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为 1: 1: 1:10:7加入到PCR管中，95 °C预变性3分钟，94 V变性30秒，50 V退火40秒，72°C延伸I分钟，25次循环后，72°C再延伸5分钟，获得183bp的核苷酸片段如下:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞嘉宁，常淑芬，田莉莉，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：