云南红梨PybHLH基因及其原核表达载体和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种云南红梨花青素生物合成、毛状体发生发育及盐胁迫调控蛋白PybHLH基因及其原核表达载体，本发明专利技术利用RT-PCR技术从云南红梨云红梨1号红色果皮中克隆PybHLH基因，然后构建了原核表达载体pGEX-4T-PybHLH，pGEX-4T-PybHLH载体在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达PybHLH蛋白，纯化后，获得云南红梨PybHLH纯化蛋白，本发明专利技术还将PybHLH基因原核表达载体应用在制备PybHLH特异性抗体中，获得的PybHLH特异性抗体还用于研究蛋白质与蛋白质以及蛋白质与DNA的相互作用以及对PybHLH转基因植物的检测，本发明专利技术获得的PybHLH特异性抗体中含有谷胱甘肽S转移酶（GST），获得的PybHLH特异性抗体运用于FarWesternblotting和免疫共沉淀实验研究蛋白质相互作用以及准确分离获得与PybHLH相互作用的蛋白质和DNA片段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨花青素生物合成、毛状体发生发育及盐胁迫调控蛋白基因及其原核表达和原核表达载体在制备PybHLH蛋白和特异性抗体中的应用。
技术介绍
红色果皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨I号四个栽培品种。但生产中除云红梨I号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB研究较多，而对植物中的bHLH和WD40蛋白研究较少。在拟南芥中LDOX基因启动子直接包括EGL3和TT8在内的不同的MYB-BHLH-TTG1转录复合物的调控，egl3、tt8和egl3 tt8功能缺失突变体试验也表明了 egl3和tt8是拟南芥幼苗花青素累积的必要条件。在拟南芥中JAZ( Jasmonate ZIM-domain)蛋白与WD-repeat/bHLH/MYB 转录复合物中的 bHLH (Transparent Testa8, Glabra3 [GL3]和 Enhancer ofGlabra3 [EGL3])和R2R3 MYB转录因子(MYB75和Glabral)互作，抑制了 JA调控的花青素的累积和毛状体的发生，而JA诱导的JAZ蛋白的降解能够解除这种抑制。在大丽花(DahI iavariabilis)中，bHLH 转录因子 DvIVS 通过调控 DvCHSl, DvF3H, DvDFR 和 DvANS 的转录来参与其花青素的生物合成。在葡萄中，bHLH转录因子MYCAl可能通过调控ANR和UFGT基因的表达来调控其花青素的生物合成。在龙胆花(G.triflora)中，GtMYB3和GtbHLH参与花青素的生物合成。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTGl (WD40)和 MYB 蛋白(GLl, PAPl、PAP2、CPC、TRY)组合，形成 MYB/bHLH/WD40 复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形 成的多功能的调控。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTGl (WDR)能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Bouyer通过克隆分析、误表达和微注射试验提出了毛状体形成的捕获_耗尽机制:在高浓度的毛状体促进蛋白GL3细胞中，GL3通过结合毛状体形成蛋白TTGl来耗尽临近细胞中的TTGl，从而导致毛状体形成，而周围的细胞因TTGl的减少而不能形成毛状体。而Zhao等人通过离子轰击试验证明了 TTGl，GL3，GLl和GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB，CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTGl复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。另外，植物中的bHLH转录因子也参与植物抗逆性机制，拟南芥中过表达0rbHLH2或OrbHLHOOl基因增强拟南芥的抗盐和抗冷的特性。在云南红梨着色机理研究方面，本实验室研究了光照对云南红梨着色的影响、构建了光诱导果皮差异表达基因的SSH文库，进行了着色相关基因的分离和表达分析。前期研究结果表明云南红梨果皮花青素的生物合成是由MYB/bHLH/WD40调控的。前期分离克隆的基因的部分片段(Λ构建的原核表达载体，由于该载体只含有PybHLH基因的一段序列而不是全长序列，获得的PybHHL抗体特异性不是很理想，不能准确的用于分离与PybHLH蛋白相互作用的蛋白质和DNA片段；在前人研究基础上，针对云南红梨栽培品种早白蜜、满天红、美人酥着色不稳定、在国内外尚未见有关云南红梨果皮红色着色机理方面研究报道，本研究选择着色最好且稳定的‘云红梨I号’作为实验材料，克隆了 ‘云红梨I号’中基因的全长序列，并且进行了序列分析、原核表达和蛋白纯化抗体制备的研究，这将为研究云南红梨转录因子PybHLH的结构和功能奠定了基础，并为作物花卉育种提供有利的科学依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种云南红梨基因，该基因主要是对云南红梨花青素生物合成、毛状体发生发育及盐胁迫调控蛋白起作用，/>况￡//基因来源于云红梨I号，云南红梨基因含有两个相连的基本亚区，即富含碱性氨基酸BASIC区域及其下游的HLH区域，其中碱性氨基酸基序与DNA的结合有关，对基因的转录发挥调控作用。本专利技术另一目的是提供云南红梨/基因的原核表达载体V從奶-PybHLH,该载体含有基因，上游有Ptac启动子和细菌核糖体结合位点RBS，Ptac启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，基因的N端含有GST标签。本专利技术另一目的是将原核表达载体应用在制备云南红梨色素合成特异性调控蛋白 PybHLH 中。本专利技术另一目的是将原核表达载体应用在制备PybHLH特异性抗体中，PybHLH特异性抗体应用在检测其在转基因植物中的表达情况、PybHLH蛋白的亚细胞定位检测、PybHLH蛋白的纯化并且在蛋白相互作用分析以及用于Far Western Blot和免疫沉淀(IP)及染色质免疫共沉淀(ChIP)中的应用。 为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案: 1、原核表达载体的构建 (I)根据苹果MdbHLH33基因(GenBank登录号为DQ266451.1)编码框，设计I对特异引物 PybHLH-F:5’ -GGATCCatggctcagaatcatgagagggtg-3 和 PybHLH-R:3’:CTCGAGgcacttaccagcaattttccaaagc,在上下游引物的5'端分别加入BamHI和XhoI酶切位点(下划线部分为酶切位点)。以云红梨I号总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PybHLH-F和PybHLH-R进行扩增； 基因全长片段的回收；基因的T/A克隆和测序； (4)/>从^7基因的生物信息学分析及GenBank登录号的获得； (5)构建原核表达载体:使用BamHI和XhoI对pMD-lST-Zy/yK质粒和pGEX_4T_l进行双酶切，分别获得5’和3’末端带有分别带有BamHI和XhoI酶切位点的/基因片段和PGEX-4T-1载体，琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16 h，获得原核表达载体认^l-M-PybHLH ； 2、PybHLH基因的原核表达 使用热刺激法将pGEX-4T-/^^yZ质粒转入大肠杆菌Rosetta (DE3)中，在IPTG诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；3、PybHLH蛋白纯化及抗体制备 收集菌体，进行超声破碎，过GST琼脂糖亲和层吸柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于制备PybHLH蛋白特异性抗体、PybHLH蛋白表达检测。本专利技术的有益效果: 本专利技术获得了基因的全长序列以及重组原核表达载体pGEX-4T-/y^K仏通过表达获得纯化蛋白，制备特异性较强的PybHLH抗体，与前期制备的抗体相比，本次专利技术获得载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
云南红梨PybHLH基因，其特征在于：PybHLH基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示或编码如SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.云南红梨/基因，其特征在于基因的核苷酸序列如SEQID N0:3所示或编码如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白质。2.权利要求1所述云南红梨基因的原核表达载体pGEX-4T-/^^yZ仏其特征在于:该载体含有/基因，上游有Ptac启动子和细菌核糖体结合位点RBS，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昆志，崔道雷，张晓东，樊磊，陈丽梅，舒群，苏俊，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：