本发明专利技术公开了一种用于水稻光敏雄性核不育基因lncR分型的引物及其应用，其中所述引物的碱基序列为：上游引物：5’-ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3’；下游引物：5’-CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’。本发明专利技术还提供了所述引物在水稻光敏雄性核不育基因lncR分型中的应用，以及在光敏雄性核不育水稻选育中的应用。本发明专利技术用于水稻光敏雄性核不育基因lncR分型的引物特异性好，将其运用到CAPS或HRM分子标记中，对水稻光敏雄性核不育基因lncR进行分型，简单，有效，准确率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业生物工程
，尤其涉及一种用于水稻光敏雄性核不育基因IncR分型的引物及其应用。
技术介绍
植物雄性不育特性可由细胞质基因引起，称细胞质雄性不育(CMS)，也可因核基因突变引起，又名核基因雄性不育(GMS)。水稻是自花授粉作物，其杂种优势利用必须依赖于雄性不育性。在杂交水稻研究和应用之初，使用的雄性不育系都是CMS类型。1973年石明松在湖北晚粳稻品种农垦58群体中发现了自发突变的光周期敏感雄性不育(photoperiod-sensitive genic male sterile, PGMS)株,后来定名为农星 58S (石明松，中国农业科学，1985，2:44-48)，开启了利用光温敏雄性不育特性培育两系法杂交水稻的序眷。经过几十年的研究，两系不育系根据其对光照长度和温度的敏感性可分为光敏不育(PGMS)、温敏不育(temperature-sensitive genic male sterility, TGMS)和光温敏核不育(P/TGMS)三类(程式华，中国农业科学，1996，29 (4): 11-16)。PGMS水稻具有长日照条件下抽穗雄性不育，短日照条件下抽穗雄性可育的基本特征，如农垦58S及其衍生的部分不育系。TGMS水稻在高温条件下抽穗雄性不育，低温条件下抽穗雄性部分可育，如安农S-1(邓华凤等，杂交水稻，1999，14(3): 1-3)，株IS (杨远柱等，杂交水稻，2000，15 (2): 6_9)等。PGMS和TGMS共同构成了目前生产上大面积应用的两系法杂交稻不育系基因的主要来源。有的水稻则对光照和温度都有一定的敏感性，在长日照、高温下抽穗表现不育，短日照、低温下表现部分可育，如培矮64S (罗孝和等，杂交水稻，1992，(1):27-29)。系谱分析表明大多早期商业化应`用的P/TGMS系主要有3个起源:农垦58S，安农S-1和株IS (斯华敏等，作物学报，2012，38 (3): 394-407)。在农垦58S衍生的后代中有些保持了光敏特性如玉兔S (赵海军等，中国水稻科学，2004，18(6):515-521)，而有些则表现为温敏特性如广占63S (杨振玉等，杂交水稻，2002，17(4):4_6)。大量遗传分析表明，PGMS 和 TGMS 都受单隐性基因控制，如安农 S-1 (Yang et al.Planta, 2007，225:321-330)，株IS (杨远柱等，中国稻米，2007，(6): 17-22)。为精细定位并最终克隆PGMS，Ding 等(PNAS, 2012，109:2654-2659)和 Zhou 等(Cell Research, 2012，22:649-660)分别以农垦58S和培矮64S为PGMS基因供体，通过和可育材料杂交建立分离群体，在精细定位确定控制农垦58S (pms3)和培矮64S (p/tgmsl2-l)雄性不育候选基因的基础上，采用遗传互补试验确定了一个位于第12号染色体上编码长链非编码RNA基因(IncR)为该不育系的PGMS基因，其在第789位碱基由C — G的转换是造成PGMS的原因。虽然在先前的研究中开发了与光敏不育基因相连锁的分子标记(Luet al.MolGen Genomics, 2005，273:507-511),但在 Ding 等(Ding et al, 2012)和 Zhou 等(Zhou etal，2012)研究中开发的与PGMS连锁的分子标记最为紧密。Ding等(Ding et al, 2012)分别在距该基因5’和3’端约5kb和5.8kb处找到了在农垦58S和DH80之间存在多态性的插入/缺失标记M4和M1，而Zhou等(Zhou et al, 2012)则在培矮64S和培矮64之间设计了标记PA301和PAIDL2，分别于突变位点的5，和3，端相距约5kb和Ikb0除上述提及的两系水稻不育系外，不同研究所还报道了不少独立发现的P/TGMS不育水稻材料，有的已经育成商用不育系在两系杂交水稻生产中应用，如琼香is (郭国强等，杂交水稻，2009，24 (I): 399-400)，绵9S(王志等，西南农业学报，1999，12 (4): 11-14)，雁农S (阳花秋等，杂交水稻，1996(1):9-10)等，但均未见有这些不育基因的分子标记的公开报道。在水稻两系不育系选育中，通常需要在田间自然条件下鉴定不育单株。但是，光温条件在各地及同一地点的不同季节存在很大差异，这对两系不育系的选育十分不利。如:(I)海南是我国水稻冬 、春季节水稻加代繁育的重要场所，但是由于日照较短，PGMS水稻一般不表现雄性不育，因此，在海南PGMS基本不能表达，从而制约了两系不育系的选育。(2)在广东等南方地区早季播种时，由于日照也较短，因此也较难开展PGMS水稻的选育工作；(3)在长江流域及北方水稻区，PGMS水稻在正常水稻生产季节都表现为不育，一旦选到不育株，需要在割茬再生后才有可能结实；并需要将稻桩带海南、让其再生分蘖才能获得种子，不但费时费力，而且严重制约可选择群体的大小。分子标记辅助选择是目前作物育种中的一种先进育种方法。对PGMS这样的性状，基于如上所说的原因，利用分子标记辅助选择育种尤为重要。因为，即使生长环境无法使其PGMS特性得以展现，利用分子标记仍然可以确定其基因型。此外，一旦确定其基因型，还可以通过调节播期有意让其在可育环境下开花结实，避免需要采用割茬再生、冷水灌溉等费力但效果欠佳的方法。但是，可能是由于没有特别适宜的分子标记，迄今尚未见基于分子标记辅助选择PGMS水稻的报道。同时，由于尚无PGMS基因特异性分子标记，迄今尚未能将PGMS基因像其他基因一样如抗稻瘟病基因(董巍等，分子植物育种，2010,8(5):853-860)和白叶枯病抗性基因(兰艳荣等，中国水稻科学，2011，25(2): 169-174)聚合在一个不育系中，提闻不育系对环境的稳定性。目前用于辅助选择育种的分子标记主要有微卫星标记或SSR标记，INDEL标记，RFLP标记，RAPD标记，AFLP标记，STS标记和基于PCR扩增的限制性酶切的CAPS或dCAPS标记(冯建成，中国农学通报，2006，22(2):43-47)。最近，利用有序列变化的扩增子之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段溶解曲线的差异进行突变检测的原理，还发展起了区分SNP的 HRM 分析方法(Reed et al.Pharmacogenomics, 2007, 8:597-608),以及基于 DNA 分子杂交的SNP芯片技术。与其他性状一样，在其基因被克隆之前，可以获得与目标性状基因无限接近、在不同品种之间具有多态性的的分子标记。根据与光敏不育紧密连锁的Ml，M4和PA301, PAIDL2 (Ding et al.2012, PNAS, 109(7):2654-2659 ；Zhou et al.2012, Cellresearch, 22:649-660)开发的分子标记只与研究的表型存在遗传上的连锁关系，在生物学上不存在因果关系，即不是功能性分子标记。这样，在实际应用中，首先要确定在研究的不育系和野生型材料之间是否存在多样性，只有在存在多样本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种引物，其特征在于，碱基序列为：上游引物：5’?ATCCCACAAATCCTTTAGCA?3’；下游引物：5’?CCGTTATAGATAGACCCGAGA?3’。
【技术特征摘要】
1.一种引物，其特征在于，碱基序列为: 上游引物:5 ’ -ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3，； 下游引物:5’ -CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’。2.如权利要求1所述的引物在水稻光敏雄性核不育基因IncR分型中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括: (1)提取水稻样品的DNA； (2)以DNA为模板，采用如权利要求1所述的引物，进行PCR扩增； (3 )用限制性内切酶Rsa I对PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳分离，成像； (4)根据成像结果，判断水稻样品的基因型: 如果只出现414bp的特征带，则该水稻样品为携带IncR基因的纯合非光敏不育材料；如果只出现329bp和85bp两条特征带，则该水稻样品为携带突变型IncR基因的纯合光敏雄性不育材料； 如果出现414bp、329bp和85bp三条特征带，则该水稻样品为携带IncR基因和突变型IncR基因的杂合材料。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系可以为:2XPCRMasterMix, 10 μ L ;10 μ M 的上游引物，0.4 μ L ;10 μ M 的下游引物，0.4 μ L ；25ng/ μ L 的 DNA, IyL ；补充无菌水至20 μ L05.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为:94°C预变性5m...
【专利技术属性】
技术研发人员：舒庆尧，张华丽，黄建中，
申请(专利权)人：浙江大学，浙江之豇种业有限责任公司，无锡求是生物农业有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。