一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点，来源于序列表中SEQ?ID?NO：1所述的人c2orf68基因，其核苷酸序列见序列表中SEQ?ID?NO：3。一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA，由人工设计合成，其核苷酸序列为序列表中SEQ?ID?NO：2所述。实验表明，将所述shRNA转染入人直肠癌细胞，shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干扰靶点可导致结直肠癌细胞的凋亡并抑制结直肠癌细胞的增殖，因此，所述短发夹shRNA可在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种短发夹shRNA及其在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
技术介绍
近年来，恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，肿瘤已成为死亡常见原因之一，严重影响着人类的健康。人结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，现在已经发现部分癌基因(如set、survivin、c_myc、Bcl_2 等)和抑癌基因(如 p53、DCC、nm23、APC、PTEN、PP2A 等)与人结直肠癌的发生、发展有密切关系，但是至今还有许多与人结直肠癌发病相关的致癌基因、抑癌基因尚未发现。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的技术。该技术已被用于疾病基因治疗领域，例如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、月巴胖症等。在抗病毒治疗方面，帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法，肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果。该技术比其它治疗手段的毒副作用会更低，因此开发更多的针对癌症的RNA干扰片段具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的短发夹shRNA，并证明所述shRNA片段可在制备治疗结直肠癌的药物中应用。人c2orf68基因已在GenBank注册，注册号NM-001013649.3，定位于2ρ11.2，全长4283bp，编码166个氨基酸，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所述。人c2orf68基因的组织表达谱分析显示:该基因在结直肠癌等胃肠肿瘤中均有表达。本专利技术所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点来源于序列表中SEQ IDNO:1所述的人c2orf68基因，是SEQ ID NO:1中第327位至345位核苷酸序列组成的基因片段，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID N0:3。本专利技术所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA由人工设计合成，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:2所述。实验表明，将所述shRNA转染入人直肠癌细胞，shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干扰靶点可导致结直肠癌细胞的凋亡并抑制结直肠癌细胞的增殖，因此，本专利技术所述短发夹shRNA在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。本专利技术具有以下有益效果:1、本专利技术为制备治疗人结直肠癌的药物提供了一种新方法，可促进人结直肠癌新药的开发。2、本专利技术所述shRNA片段不仅可应用于制备治疗人结直肠癌的药物，而且可用于人c2orf68基因在结直肠癌发病中的作用和机理研究。附图说明图1是荧光定量PCR实验中人c2orf68基因引物的标准曲线图。图2是荧光定量PCR实验中内参gapah基因引物的标准曲线图。图3是人结直肠癌细胞株SW480的siRNA组(转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480)、阴性对照组SW480_、空白对照组(未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480)中人c2orf68基因表达的柱状图。图4是人结直肠癌细胞株SW620的siRNA组(转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620)、阴性对照组 SW620_、空白对照组(未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620)中人c2orf68基因表达的柱状图。图5是流式细胞仪检测转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480-siRNA、阴性对照细胞株SW480-NC和未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480的细胞凋亡图。图6是流式细胞仪检测SW480-siRNA、SW480-NC、SW480细胞株的细胞凋亡率柱状图。图7是流式细胞仪检测转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620-siRNA、阴性对照细胞株SW620-NC和未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620的细胞凋亡图。图8是流式细胞仪检测SW620-siRNA、SW620-NC、SW620细胞株的细胞凋亡率柱状图。图9是MTT实验中SW480-siRNA、SW480-NC、SW480细胞株的生长曲线图。图10是MTT实验中SW620-siRNA、SW620-NC、SW620细胞株的生长曲线图。具体实施例方式下面结合实施例，对本专利技术作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook, Russell的分子克隆；实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1:RNA干扰靶点的确定及shRNA的设计与合成以人c2orf68基因的mRNA序列作为基础,采用siRNA在线设计软件(http://www.ambion.com)设计短发夹shRNA, siRNA在线设计软件显示RNA干扰祀点的核苷酸序列是SEQID NO:1中第327位至345位的核苷酸序列，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO:3。根据所述靶序列设计了一对短发夹shRNA，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:2所述。shRNA通过化学合成方法制备，委托有关专业公司合成(广州锐博生物科技有限公司)。实施例2:短发夹shRNA的干扰效率实验1、细胞培养用胎牛血清的体积比为10%的DMEM高糖培养基(从HyClone公司购买)于37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养人结直肠癌SW480细胞株和SW620细胞株(SW480、SW620从美国ATCC公司购买)至铺满培养瓶。2、shRNA 转染 SW480 细胞和 SW620 细胞2.1分别取培养瓶中1/6人结直肠癌SW480细胞和SW620细胞接种于6孔细胞培养板的每一孔中；2.2 24h后细胞培养板覆盖率约达70% 80%，丢弃原培养基。将6孔板中的细胞用2ml DMEM高糖培养基(无血清，无抗生素)培养4h ；2.3 于 EP 管内配制 A 液:5μ I (20ymol/L) shRNA+250ul DMEM 培养基(无血清，无抗生素)，混合均匀；于EP 管内配制 B 液:Lipofectamine 2000 (invitrogen 公司)+25Oul DMEM 培养基(无血清，无抗生素)，混合均匀；室温静置5min ；于EP管内 配制C液:A液+B液，混合均匀，室温静置25min ；2.4弃细胞培养板内原有的培养基，每孔各加入新鲜的1.5ml DMEM高糖培养基(无血清，无抗生素)；2.5将C液逐滴逐滴的加入到培养板中，每孔各500 μ I ;2.6将转染shRNA的SW480细胞和SW620细胞放入37°C、5% CO2细胞培养箱孵育；实验设置3个组，分别为实验组、空白对照组、阴性对照组；2.7 6h后，弃细胞培养板内原有的培养基，每孔各加入2ml含胎牛血清的DMEM高糖培养基；放入37°C、5% CO2细胞培养箱孵育。3、总RNA的提取3.1取转染shRNA片段48h后的结直肠癌SW480细胞和SW620细胞，加入TRIzol试剂(invitrogen公司)lml，然后转移至Ij 1.5ml的Eppendorf管中，室温静置5min ；3.2加入0.2ml的氯仿，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点，其特征在于它来源于序列表中SEQ?ID?NO：1所述的人c2orf68基因，是SEQ?ID?NO：1中第327位至345位核苷酸序列组成的基因片段，其核苷酸序列为序列表中SEQ?ID?NO：3所述。
【技术特征摘要】
1.一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点，其特征在于它来源于序列表中SEQ ID NO:1所述的人c2orf68基因，是SEQ ID NO:1中第327位至345位核苷酸序列组成的基因片段，其核苷酸序列为序列表中SEQ I...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈尧，温晓霞，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：
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