一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法技术

本发明专利技术提供一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法。一种用于间充质干细胞动员的制剂，包括CoCl2。所述的CoCl2为缺氧模拟剂，剂量范围5-20mg/kg。所述的CoCl2与AMD3100联合使用。所述的AMD3100剂量为5mg/kg。一种利用所述的制剂分离间充质干细胞的方法，利用所述的制剂促使间充质干细胞动员进入外周血然后进行分离。所述的分离步骤如下：采取外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，接种至培养瓶，培养7天后换液，第10天得到外周血间充质干细胞。所述的外周血间充质干细胞高表达CD90、CD29、CD44，不表达CD45、CD34；具有体外成骨、成脂、成软骨分化能力。本发明专利技术具有较高的MSCs动员效率，为组织工程与再生医学等提供了一种有效的制剂和方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，主要涉及。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是具有强大的增殖能力和多向分化潜能的成体干细胞。由于在一定条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、神经等组织，MSCs已成为组织工程与再生医学十分有潜力的种子细胞。MSCs临床应用前景广阔:治疗骨、关节、肌腱缺损与损伤；促进神经细胞、心肌细胞、肝细胞再生；支持造血，促进造血干细胞植入；预防及治疗造血干细胞移植后移植物抗宿主病(GVHD);免疫调节治疗自身免疫紊乱性疾病等。骨髓为MSCs最为丰富的来源，在目前的临床试验与应用中，从供者或自身抽取一定量骨髓、体外分离培养为获取MSCs的主要途径。此方法可行易掌握，但也存在一些缺点:细胞来源受限、培养步骤繁琐、扩增到所需细胞量需要时间较长、培养液添加物非人源化、污染问题、致瘤风险等。MSCs体内动员方法的建立可以避免体外培养后移植治疗的诸多缺点，为MSCs的临床应用开辟新途径。动员(Mobili zation)是指干细胞由原组织位点进入外周循环的过程。干细胞动员是十分有潜力的疾病治疗方法，如造血干细胞动员目前已广泛应用于临床。间充质干细胞动员指应用动员剂或采用动员措施促使骨髓中MSCs释放并迁移到外周血。有效的MSCs动员可以避免体外培养后输注治疗存在的细胞污染、培养时间过长容易错过最佳治疗时间窗等缺点。MSCs体内动员具有体外培养后移植无法比拟的低创和高效性，因此对MSCs体内动员方法的研究十分有意义。许多研究者也曾尝试采用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员MSCs，但结果令人失望。目前尚缺乏有效而临床可行的MSCs动员剂。在前期研究中，我们首创性地发现缺氧诱导因子I a (HIF-1 α )是间充质干细胞动员中的关键因子(Stem Cells Dev.2011 20 (11): 1961-71)。我们建立了缺氧诱导大鼠MSCs动员的动物模型，通过检测缺氧诱导MSCs动员的动力学，我们发现短期缺氧即可动员大鼠MSCs，经过鉴定动员进入外周血MSCs的免疫表型及成骨、成脂、成软骨能力与骨髓来源MSCs基本相似。在进一步的机制研究中，我们证实了 HIF-1a在缺氧诱导MSCs动员中起枢纽作用，而 HIF-1 a下游通路基质细胞衍生因子-1 a (SDF-1 a )及其受体CXCR4参与MSCs动员。HIF-1是一个包含有HIF-1 a与HIF-1 β两个亚基的异源二聚体。HIF-1 β是许多转录因子所共有的亚基，在细胞内呈构成性表达。HIF-1a则为HIF-1的调节亚基与活性亚基。HIF-1的生理活性主要取决于HIF-1 a亚基的活性和表达。HIF-1a表达量增加的调节主要在蛋白翻译后水平，即通过增加蛋白的稳定性，抑制其降解来实现。细胞处于常氧状态时，在脯氨酰轻化酶(prolyl hydroxylase, PHD)的作用下，HIF-1 α分子中402位和564位的脯氨酸残基被羟化。被羟化的HIF-1a可与肿瘤抑制蛋白von HippelLindau (VHL)结合，后者可被识别发生泛素化降解。在该降解途径中，PHD是起关键作用的酶。PHD属于Fe2+、2_酮戊二酸依赖的双加氧酶超家族，是HIF-1 α降解反应的限速酶。PHD抑制剂可以稳定HIF-1 α的表达。研究发现，铁螯合剂氯化钴(CoCl2)可以抑制PHD的活性，而抑制HIF-1 α的羟化，减少常氧状态下HIF-1 α的降解，被称为“缺氧模拟剂”。SDF-1/ CXCR4轴在干细胞体内动员中起着重要的作用。基质细胞衍生因子(SDF-1)是由骨髓基质细胞产生的CXC型趋化因子，CXC族细胞因子受体4 (CXCR4)是目前所知的SDF-1的唯一受体。研究证实，SDF-1在内皮细胞受转录因子HIF-1直接调控。AMD3100为SDF-1 a /CXCR4轴的小分子拮抗剂，能够有效阻断SDF-1 α与CXCR4的相互作用而对CXCR4没有激动作用。虽然根据文献报道和我们前期研究结果可知HIF-l/SDF-1 a -CXCR4轴在MSCs动员中起关键作用，但是目前尚缺少一种有效的MSCs动员制剂，仍缺乏可行的MSCs动员方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术人首次发现缺氧模拟剂氯化钴(CoCl2)可以诱导大鼠MSCs动员至外周血，而CoCl2联合CXCR4的抑制剂AMD3100可显著提高动员效率。本专利技术提供了。一种用于间充质干细胞动员的制剂，包括CoCl2。所述的CoCl2为缺 氧模拟剂，剂量范围5_20mg/kg。所述的CoCl2与八1 3100联合使用。所述的 AMD3100 剂量为 5 mg/kg。一种利用所述的制剂分离间充质干细胞的方法，利用所述的制剂促使间充质干细胞动员进入外周血然后进行分离。所述的分离步骤如下:采取外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，接种至培养瓶，培养7天后换液，第10天得到外周血间充质干细胞。所述的外周血间充质干细胞高表达⑶90、⑶29、⑶44，不表达⑶45、⑶34 ;具有体外成骨、成脂、成软骨分化能力。本专利技术的有益效果:具有较高的MSCs动员效率，为组织工程与再生医学等提供了一种有效的制剂和方法。附图说明图1为氯化钴(CoCl2)诱导大鼠MSCs动员至外周血，而CoCl2联合CXCR4的抑制剂AMD3100可显著提高动员效率。图1 A:各处理组大鼠外周血CFU-F数。图中，CFU-F:成纤细胞样集落。NS组:生理盐水处理组。CoCl2组:CoC12 10mg/kg/dX 7d处理组。AMD:AMD3100处理组即第f 7天给予相应体积生理盐水，第8天给予AMD31005mg/kg。AMD+ CoCl2:AMD3100 联合 CoCl2 组，先给予 CoC12 10mg/kg/dX 7d，第 8 天腹腔注射 AMD3100 5mg/kg。* 表示与 NS 组相比，Ρ〈0.05。** 表示与 AMD3100 组相比，Ρ〈0.05。#表示CoCl2组相比，Ρ〈0.05。图1B:各处理组大鼠外周血⑶45TD90+细胞的比例示意图。图中，NS组:生理盐水处理组。CoCl2组:CoCl2 10mg/kg/dX7d处理组。AMD:AMD3100处理组即第1~7天给予相应体积生理盐水，第8天给予AMD3100 5mg/kg。AMD+CoCl2:AMD3100 联合 CoCl2组，先给予 CoCl2 10mg/kg/dX 7d，第 8 天腹腔注射 AMD3100 5mg/kg 图2为动员外周血来源MSCs的免疫表型。图中，动员外周血来源MSCs高表达CD90、CD29、CD44，而不表达CD45、CD34。图3为动员外周血来源MSCs可以向成骨、成脂、成软骨分化。图3A =PB-MSCs成骨诱导分化第14天光镜照片(100X )。图3B =PB-MSCs成骨诱导分化第14天Von Konssa染色结果图(100 X )。图3C =PB-MSCs成脂诱导分化第21天光镜照片(200X )。图3D =PB-MSCs成脂诱导分化第21天油红O染色结果示意图(200X )。图3E =PB-MSCs成软骨诱导分化第21天本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于间充质干细胞动员的制剂，其特征在于，它包括CoCl2。

【技术特征摘要】
1.一种用于间充质干细胞动员的制剂，其特征在于，它包括CoCl2。2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的CoCl2为缺氧模拟剂，剂量范围5_20mg/kg。3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的CoCl2与AMD3100联合使用。4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述的AMD3100剂量为5mg/kg。5.一种利用权利要求1或2所述的制剂分离间充质干细胞的方法，其特征在于，利用所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄河，刘丽珍，余勤，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：