一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，通过人工诱变育种，及工艺配方、培养条件的优化，使得原本在不同条件下培养，且分别具有不同生理功能的三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3，通过固体培养、摇瓶种子制备，然后将三株地衣芽孢杆菌的摇瓶种子液合瓶后，经过一级种子液制备、二级种子液制备，最后于同一发酵罐内发酵培养。采用本发明专利技术的混合发酵工艺，抑菌能力提高10～15%，芽孢率提高了16～23%，节约成本200%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，属于微生物发酵领域。
技术介绍
地衣芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的一种，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌，能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染等行业。地衣芽孢杆菌是我国20世纪90年代起开发利用的新型微生态制剂，其消长直接影响该制剂的疗效和产量的高低。目前，地衣芽孢杆菌的生产方法按发酵方式可分为固体发酵和液体发酵。但长期以来，无论采用那何种发酵方式，生产成本一直据高不下，工业生产成本难以大幅度降低。国内外已有许多学者对地衣芽孢杆菌的发酵条件进行研究，以求提高产量,降低生产成本。保藏于中国农业微生物菌种保藏中心的三株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)Ll、L2、L3，其中，保藏编号为ACCC11080的地衣芽孢杆菌LI，具有分解木质素，促进生长的功能；保藏编号为ACCC10613的地衣芽孢杆菌L2，能产生杆菌肽，具有抑制细菌性及霉菌性根腐病的功能；保藏编号为ACCC11106的地衣芽孢杆菌L3，能抗梨黑星病。目前，上述三株地衣芽孢杆菌的发酵方式通常为:单株发酵得到L1、L2、L3的发酵液，然后将所得发酵液混合，再进行浓缩、制粒、干燥，从而得到最终产品。采用此发酵方式，生产成本较高，且受发酵工艺的影响，批次制得的产品性能并不稳定。为此，开发合理的地衣芽孢杆菌发酵方式，降低生产成本，是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷与不足，提供一种抑菌能力高、生产成本低的地衣芽孢杆菌混合发酵工艺。`为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案:一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)分别为L1、L2、L3,保藏于中国农业微生物菌种保藏中心；其中，LI的保藏编号为ACCC11080，L2的保藏编号为ACCC10613，L3的保藏编号为ACCC11106 ;包含以下步骤:a)固体斜面培养:将三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行分别培养，其中:地衣芽孢杆菌LI的培养条件为30 37°C，24 48h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为25 30°C，24 48h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为28 32°C，24 48h ；b)理化因子诱变:将步骤a)中制得的固体斜面培养物，在无菌条件下，用0.9%的生理盐水制备成浓度为IO8 IO9个/ml (血球计数浓度)的菌悬液；并将制得的菌悬液按致死率70% 90%的处理剂量进行紫外诱变处理，进行摇瓶筛选，根据摇瓶筛选结果，选择正突变的菌株，进行亚硝基胍诱变处理，用0.9%的生理盐水将亚硝基胍诱变处理后的反应液稀释后涂布分离平板，接入分离平板培养基，于30°C培养48h，至长出单菌落；c)摇瓶筛选:无菌条件下，将步骤b)中制得的单菌落从分离平板上分别接入斜面培养基，于30°C培养48h，得单菌落斜面；然后将单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基，于30°C恒温振荡培养22h，得筛选种子液；再在无菌条件下，将筛选种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30°C恒温振荡培养48h，以芽孢率、抑菌能力(生物圈)、生物量为指标，进行摇瓶初筛、摇瓶一次复筛及摇瓶二次复筛；d)根据步骤c)中的二次复筛结果，选取芽孢率彡90%、抑菌圈彡20mm、生物量^ 20%的菌株，用接种针接入斜面培养基，于30°C培养48h，得二代种子斜面，然后在无菌条件下，将二代种子斜面用接种铲接入种子摇瓶培养基，于30°C培养22h，得摇瓶种子液；e)发酵培养:将步骤d)中的摇瓶种子液合瓶，然后接种种子罐培养基，经过一级种子液和二级种子液制备后，进入发酵罐接种发酵培养基进行培养，培养温度为30±0.5°C，罐压:0.03 0.05MPa, pH 值为 6.3 6.6，流量 1:0.3 ~ 1:0.8，转速 300rpm,至芽孢率大于85%时放罐。进一步地:步骤a)、c)和d)中所述的斜面培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖0.2 2.5%、蔗糖0.5 3.5%、酵母粉0.1 2.0%、牛肉膏0.5 1.5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、磷酸氢二铵0.1 2.0%、氯化钠0.5 3.5%、硫酸锰0.005 0.1%、硫酸铵0.5 3.5%、磷酸氢二钾0.1 0.5%、硫酸镁0.1 0.5%、琼脂1.5 2.2%，余量为水；pH值为6.5 7.5o进一步地:步骤b)中所述的紫外诱变处理方式为:将菌悬液暴露在256nm波长的紫外线下，距离30cm，振摇608、908、1208、然后于暗光处，301:培养16h。进一步地:步骤b)中所述的亚硝基胍诱变处理方式为:将菌悬液与200mg/L的亚硝基胍溶液等体积混合， 于37°C下作用30min，而后立即用等量的pH8.0的磷酸缓冲液终止反应。进一步地:步骤b)中所述的分离平板培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖0.2 2.5%、酵母粉0.1 2.0%、牛肉膏0.5 1.5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、氯化钠0.5 3.5%、硫酸锰0.005 0.1%、硫酸铵0.5 3.5%、磷酸氢二钾0.1 0.5%、硫酸镁0.1 0.5%、琼脂1.5 2.2%，余量为水；pH为6.5-7.5。进一步地:步骤c)中所述的摇瓶发酵培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖2 4.5%、黄豆饼粉I 3.5%、玉米粉0.8 2.0%、酵母粉0.2 1.0%、磷酸二氢钾0.2 1.0%、磷酸氢二钠0.2 1.0%、硫酸镁0.02 0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。进一步地:步骤c)与步骤d)中所述的种子摇瓶培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖1.0 2.5%、黄豆饼粉1.0 2.5%、酵母粉0.2 1.0%、蛋白胨0.2 1.0%、玉米浆0.2 L 5%、磷酸二氢钾0.2 L 0%、磷酸氢二钠0.2 L 0%、硫酸镁0.02 0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。进一步地:步骤e)中所述的种子罐培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖1.0 2.5%、黄豆饼粉1.0 2.5%、酵母粉0.2 1.0%、蛋白胨0.2 1.0%、玉米浆0.2 1.5%、磷酸二氢钾0.2 1.0%、磷酸氢二钠0.2 1.0%、硫酸镁0.02 0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。进一步地:步骤e)中所述的发酵培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖2 4.5%、黄豆饼粉I 3.5%、玉米粉0.8 2.5%、酵母粉0.2 2.5%、磷酸二氢钾0.2 2.5%、磷酸氢二钠0.2 2.5%、硫酸镁0.02 0.25%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。本专利技术有益效果在于，相对于常规的单株分别发酵，然后将所得发酵液混合，再进行浓缩、制粒、干燥，从而获得产品的方法，本专利技术通过诱变育种，改变了菌种的成长特性，优化了发酵工艺，使得原本在不同培养条件下培养，且分别具有不同生理功能的三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3，通过固体培养、摇瓶种子制备，然后将三株地衣芽孢杆菌的摇瓶种子液合瓶，经过一级种子制备、二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，所述地衣芽孢杆菌（Bacillus?licheniformis）分别为L1、L2、L3，保藏于中国农业微生物菌种保藏中心；其中，L1的保藏编号为ACCC11080，L2的保藏编号为ACCC10613，L3的保藏编号为ACCC11106；其特征在于，包含以下步骤：a）固体斜面培养：将三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行分别培养，其中：地衣芽孢杆菌L1的培养条件为30～37℃，24～48h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为25～30℃，24～48h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为28～32℃，24～48h；b）理化因子诱变：将步骤a）中制得的固体斜面培养物，在无菌条件下，分别用0.9%的生理盐水制备成浓度为108～109个/ml（血球计数浓度）的菌悬液；然后将制得的菌悬液进行紫外诱变处理，按照致死率70%～90%的处理剂量进行摇瓶筛选，根据摇瓶筛选结果，选择正突变的菌株，进行亚硝基胍诱变处理，并用0.9%的生理盐水将亚硝基胍诱变处理后的反应液稀释后涂布分离平板，接入分离平板培养基，于30℃培养48h，至长出单菌落；c）摇瓶筛选：无菌条件下，将步骤b）中制得的单菌落从分离平板上分别接入斜面培养基，于30℃培养48h，得单菌落斜面；然后将单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基，于30℃恒温振荡培养22h，得筛选种子液；再在无菌条件下，将筛选种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30℃恒温振荡培养48h，以芽孢率、抑菌能力（抑菌圈）、生物量为指标，进行摇瓶初筛、摇瓶一次复筛及摇瓶二次复筛；d）根据步骤c）中的二次复筛结果，选取芽孢率≥90%、抑菌圈≥20mm、生物量≥20%的菌株，分别用接种针接入斜面培养基，于30℃培养48h，得二代种子斜面，然后在无菌条件下，将二代种子斜面用接种铲接入种子摇瓶培养基，于30℃培养22h，得摇瓶种子液；e）发酵培养：将步骤d）中的摇瓶种子液合瓶，然后接种种子罐培养基，经过一级种子液和二级种子液制备后，进入发酵罐接种发酵培养基进行培养，培养温度为30±0.5℃，罐压：0.03～0.05MPa，pH值为6.3～6.6，流量1:0.3～1:0.8，转速300rpm，至芽孢率大于85%时放罐。...

【技术特征摘要】
1.一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)分别为L1、L2、L3,保藏于中国农业微生物菌种保藏中心；其中，LI的保藏编号为ACCCl 1080，L2的保藏编号为ACCC10613，L3的保藏编号为ACCCl1106 ;其特征在于，包含以下步骤: a)固体斜面培养:将三株地 衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行分别培养，其中:地衣芽孢杆菌LI的培养条件为30 37°C，24 48h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为25 30°C，24 48h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为28 32°C，24 48h ； b)理化因子诱变:将步骤a)中制得的固体斜面培养物，在无菌条件下，分别用0.9%的生理盐水制备成浓度为IO8 IO9个/ml (血球计数浓度)的菌悬液；然后将制得的菌悬液进行紫外诱变处理，按照致死率70% 90%的处理剂量进行摇瓶筛选，根据摇瓶筛选结果，选择正突变的菌株，进行亚硝基胍诱变处理，并用0.9%的生理盐水将亚硝基胍诱变处理后的反应液稀释后涂布分离平板，接入分离平板培养基，于30°C培养48h，至长出单菌落； c)摇瓶筛选:无菌条件下，将步骤b)中制得的单菌落从分离平板上分别接入斜面培养基，于30°C培养48h,得单菌落斜面；然后将单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基,于30°C恒温振荡培养22h，得筛选种子液；再在无菌条件下，将筛选种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30°C恒温振荡培养48h，以芽孢率、抑菌能力(抑菌圈)、生物量为指标，进行摇瓶初筛、摇瓶一次复筛及摇瓶二次复筛； d)根据步骤c)中的二次复筛结果，选取芽孢率>90%、抑菌圈> 20mm、生物量> 20%的菌株，分别用接种针接入斜面培养基，于30°C培养48h，得二代种子斜面，然后在无菌条件下，将二代种子斜面用接种铲接入种子摇瓶培养基，于30°C培养22h，得摇瓶种子液； e)发酵培养:将步骤d)中的摇瓶种子液合瓶，然后接种种子罐培养基，经过一级种子液和二级种子液制备后，进入发酵罐接种发酵培养基进行培养，培养温度为30±0.5°C，罐压:0.03 0.05MPa, pH值为6.3 6.6，流量1:0.3 1:0.8，转速300rpm，至芽孢率大于85%时放罐。2.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于:步骤a)、c)、d)中所述的斜面培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖0.2 2.5%、蔗糖0.5 3.5%、酵母粉0.1 2.0%、牛肉膏0.5 1.5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、磷酸氢二铵0.1 2.0%、氯化钠0.5 3.5%、硫酸锰0.005 0.1%、硫酸铵0.5 3.5%、磷酸氢二钾0.1 0.5%、硫酸镁0.1 0.5%、琼脂1.5 2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓红，刘姝静，朱慧平，张中亲，
申请(专利权)人：山西凯盛肥业有限公司，
类型：发明
国别省市：