枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法技术

本发明专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法，包括在发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌PTS-394种子液，在摇床上发酵培养2d，其特征在于：发酵培养基中的碳源为玉米淀粉，氮源为大豆粉，影响菌含量预测值的三个关键因子为玉米淀粉、大豆粉和酵母粉，在发酵培养基中的三个关键因子含量依次为11.48g/L、13.35g/L和0.90g/L，发酵培养条件中影响菌含量和抑菌圈直径的三个关键因子为温度、初始PH值和装液量，它们在发酵培养过程中选择：温度30.84℃，初始PH6.93，装液量65.15mL/250mL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法，尤其是一种利用Plackett-Burman法和响应曲面法优化发酵培养基及培养条件后实现对枯草芽孢杆菌PTS-394的培养方法。
技术介绍
随着种植业结构的调整，设施蔬菜种植面积逐年增加，高产、连作的设施蔬菜种植布局为病虫害提供了充裕的营养和繁殖条件。近年来设施茄果类蔬菜土传病害(青枯病、疫病、根结线虫等)频繁暴发。青枯病是一种毁灭性土传细菌病害，发病初期地上部分虽表现为萎垂但叶片仍保持绿色，故名“青枯”。青枯病是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一，被称为植物的“癌症”。在我国主要农作物中以番茄、辣椒等茄科植物受青枯病的危害最为严重。一般田块的发病率为10%-15%，重病田的发病率高达80%-100%。目前，生产上防治设施茄·果类蔬菜青枯病主要依靠化学农药。这不仅造成生态环境严重污染，而且直接增加蔬菜中有毒化学物质的残留，对人类健康带来严重危害。为了解决蔬菜产量和质量之间矛盾，达到防治植物病害、减少化学农药的使用量的目的，使用生物防治控制植物病害的方法越来越受到各国政府和人民的关注。江苏省农科院植保所筛选获得的、对茄果类蔬菜青枯病有很好防效的枯草芽孢杆菌PTS-394，并于2011年11月I日申请了专利，公开号为CN102550607A。其中公开的形态特征记载为:菌株营养体为杆状，两端椭圆，周生鞭毛。大小为(0.7-0.8)微米X (2.0-3.0)微米。无荚膜。芽孢中生，椭圆形，大小为(0.6-0.9)微米X (1.0-1.5)微米。枯草芽孢杆菌PTS-394在牛肉汁蛋白胨琼脂平板上培养时，菌落边缘波浪形，米色，表面有皱褶。质地为不透明状，不产生色素。革兰氏反应阳性。H2O2酶反应阳性，V.P.反应阳性。L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇利用为阳性。淀粉水解、明胶液化、柠檬酸钠利用、二羟基丙酮形成反应也均为阳性。此外，枯草芽孢杆菌PTS-394还具有许多优良性能，如:有较广的抑菌谱，对多种植物病原菌有很强的抑制作用；生长速度快，适应环境能力强，能在土壤和植物表面定殖，并形成优势种群；诱导寄主产生抗病性；分泌产生多种抗菌物质。目前，江苏省扬州市绿源生物有限公司已生产了 200亿枯草芽孢杆菌PTS-394活菌水剂。枯草芽孢杆菌PTS-394活菌制剂中的菌含量是产品的一个重要技术和经济指标。要提高发酵液中菌含量，就必须对其发酵培养基成分及配比、培养条件各个参数进行优化。近年来,研究人员利用Plackett-Burman(PB)实验设计方法可以快速从影响因素中筛选出对目标值影响最大的关键因子，并能为爬坡实验指出方向和变化步长，已广泛应用于微生物发酵培养基成分和工艺参数的筛选。响应曲面法(Response Surface Method,RSM)是一种适用性强且简易可靠的统计学实验设计优化方法，是一种优化生物过程的综合技术。国内已有许多关于采用响应曲面法对微生物发酵过程进行优化的报道。目前,利用Plackett-Burman法和响应曲面法优化获得的以提高枯草芽孢杆菌PTS-394发酵菌液中活菌量为目的的发酵培养基和培养条件，未见诸报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于:针对目前枯草芽孢杆菌PTS-394活菌制剂中的菌含量较低的实际问题，提供一种基于传统的枯草芽孢杆菌PTS-394发酵培养方法，对其中的发酵培养基和培养条件进行优化，提高发酵液中菌含量。本专利技术的目的是这样实现的:一种枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法，包括在发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌PTS-394种子液，在摇床上发酵培养2d，其特征在于:发酵培养基中的碳源为玉米淀粉，氮源为大豆粉，影响菌含量预测值的三个关键因子为玉米淀粉、大豆粉和酵母粉，在发酵培养基中的三个关键因子含量依次为11.48 g/L、13.35 g/L和0.90 g/L,发酵培养条件中影响菌含量和抑菌圈直径的三个关键因子为温度、初始PH值和装液量，它们在发酵培养过程中选择:温度30.84°C，初始PH 6.93，装液量65.15 mL/250mL。。在本专利技术中:发酵培养基的组分为:玉米淀粉11.48 g/L、大豆粉13.35 g/L和酵母粉0.90 g/L、CaC03 3 g，NaCl 0.5 g，鱼粉10 g ;发酵培养基的装液量为65.15 mL/250mL,发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌PTS-394的种子液后，初始pH 6.93，置于30.84°C，摇床发酵培养。在本专利技术中:发酵培养2d，发酵液中的菌含量为(6.38±0.16)E+10 cfu/mL，对青枯病菌抑菌圈直径为32.12±0.08 mm。本专利技术的优点在于:由于枯草芽孢杆菌PTS-394活菌制剂中的有效菌含量是产品的一个重要技术和经济指标。本专利技术利用改良后的优化培养基组分及配比和培养条件，提高枯草芽孢杆菌PTS-394发酵菌液中菌含量，为枯草芽孢杆菌PTS-394高效防治青枯病提供理论依据。具体实施方式实施例1确定培养基碳源、氮源 枯草芽孢杆菌PTS-394的基础发酵培养基(由公开号为CN102550607A的专利申请中实施例3公开):玉米粉20 g，豆饼粉10 g，大豆粉5 g，酵母粉1.5 g，CaCO3 3 g，NaCl 0.5g，鱼粉 10 g，补水至 1000 mL, pH 7.5。将上述基础发酵培养基的20 g/L玉米粉以蔗糖，可溶性淀粉，玉米淀粉，麦芽糖，乳糖，木糖6种不同碳源等量(20 g/L)替换，配成不同碳源的培养基。将基础发酵培养基的10 g/L豆饼粉以大豆粉，胰蛋白胨，酵母浸粉，牛肉膏，蛋白胨，鱼粉6种不同氮源等量(10g/L)替换，配成不同氮源的培养基。将不同碳、氮源的培养基pH调中性后分装，装液量为100 mL/250 mL三角瓶，灭菌。以2%的接种量接种枯草芽孢杆菌PTS-394种子液(菌含量为2.11E+10 cfu/mL)后，置于28°C，150 rpm的摇床中摇培48 h，采用平板稀释法检测发酵液菌含量，每个处理设3个重复，取平均值。碳源、氮源筛选试验结果见表I。表I不同碳源、氮源对PTS-394发酵液菌含量的影响本文档来自技高网...

【技术保护点】
枯草芽孢杆菌PTS?394的发酵培养方法，包括在发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌PTS?394种子液，在摇床上发酵培养2d，其特征在于：发酵培养基中的碳源为玉米淀粉，氮源为大豆粉，影响菌含量预测值的三个关键因子为玉米淀粉、大豆粉和酵母粉，在发酵培养基中的三个关键因子含量依次为11.48?g/L、13.35?g/L和0.90?g/L，发酵培养条件中影响菌含量和抑菌圈直径的三个关键因子为温度、初始PH值和装液量，它们在发酵培养过程中选择：温度30.84℃，初始PH?6.93，装液量65.15?mL/250?mL。

【技术特征摘要】
1.枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法，包括在发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌PTS-394种子液，在摇床上发酵培养2d，其特征在于:发酵培养基中的碳源为玉米淀粉，氮源为大豆粉，影响菌含量预测值的三个关键因子为玉米淀粉、大豆粉和酵母粉，在发酵培养基中的三个关键因子含量依次为11.48 g/L、13.35 g/L和0.90 g/L，发酵培养条件中影响菌含量和抑菌圈直径的三个关键因子为温度、初始PH值和装液量，它们在发酵培养过程中选择:温度 30.84。。，初始 PH 6.93，装液量 65.15 mL/250 mL。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌PTS-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘邮洲，乔俊卿，陈志谊，王治林，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：