本发明专利技术公开了一种细胞集落生长装置。本发明专利技术所提供的装置包括具有若干微图形空腔的微图形化模板和位于所述微图形化模板下的粘性水凝胶，两者交联粘着为整体；每个所述微图形空腔的形状和尺寸决定细胞集落生长的物理空间。用作所述粘性水凝胶的材料由可交联形成水凝胶的天然生物材料和/或人工合成生物材料，以及交联剂组成。本发明专利技术所提供的平台制备工艺简单，配合培养皿使用简便易行；利用微图形化技术构建多种细胞共培养环境，为高通量模型构建和筛选提供了方便实用的手段；同时还可实现对细胞集落形状和尺寸、粘附基底机械强度和化学成分、生长因子和化学信号、共培养细胞等多种因素的独立调控；以及原位进行细胞增殖培养和诱导分化培养。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细胞集落生长装置，特别涉及一种实现全能干细胞集落均质性生长的装置，同时也涉及利用该装置调控全能干细胞的自我更新和定向分化的方法。
技术介绍
全能干细胞(totipotent stem cell, TSC)是指具有无限分化潜能,能分化成所有组织和器官的干细胞，主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)和诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPS)两类。胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎中分离培养出来的，其特点是具有发育的全能性，参与整个生物体的发育，并构成人体的各种组织和器官。胚胎干细胞取自原肠胚期的囊胚，进一步分化可形成专能干细胞。如肝脏祖细胞，骨髓造血干细胞等。从技术角度来说，“全能性”的胚胎干细胞对于治疗性克隆来说是最理想的。然而，由于人类胚胎干细胞研究触及伦理和道德，在很多国家被法律禁止，相关研究也处于进退两难的境地。2007年，日本和美国科学家分别宣布发现将普通皮肤细胞转化为干细胞的方法，这样得到的干细胞和具有与胚胎干细胞类似的功能，被称为诱导多功能干细胞，即iPS细胞。这一发现分别被《自然》和《科学》两大权威科学杂志评为当年重大科学进展。iPS细胞是“初始化”后的普通体细胞，但具有和胚胎干细胞类似的功能，能分化生成各种组织细胞。更重要的是，它绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，医疗领域的应用前景非常广阔。美国、日本等许多国家更是以极大热情，或加大投入，或制订鼓励政策，推动这一新兴的干细胞研究。中国干细胞基础研究和应用研究起步较早，2001年后，与干细胞相关的重大研究项目不少于二十个。此外，国家还在研发网络建设、人才建设、研究平台搭建等方面给予了大力支持，为中国在该研究领域的优势地位奠定了基础。中科院动物研究所周琪和北京生命科学研究所高绍荣的研究团队分别利用iPS细胞克隆出小鼠，从而在世界上首次证明了 iPS细胞的全能性，说明完全通过体外操作可得到与胚胎干细胞具有同样分化能力的细胞。这项成果是从干细胞研究迈向实际医疗过程中的一大步，对干细胞全能性的机理研究以及器官移植、药物筛选、基因治疗等临床应用研究具有重要价值。全能干细胞的集落性生长 对于干细胞全能性的维持具有非常重要的作用。以人胚胎干细胞(hESC)为例，经典培养方法是在以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为代表的经过灭活的饲养层细胞上进行的，同时也有研究证实，在合适的化学因素作用下，细胞外基质也能作为培养基底维持hESC的自我更新，如基质胶、胶原、层连接蛋白、纤维连接蛋白中的一种或其混合物。在单细胞状态下，hESC的存活率较低，因此经典的传代方法是将其集落消化或切碎成为含有约100个细胞的团簇。无论采用何种传代技术，操作关键是将hESC保持在细胞团簇的状态。然而，这种方法很大程度上取决于操作人员的素质和手法，并最终形成形状和大小随机的、细胞密度随机的、异质性的hESC集落，但同时过大或者过小的细胞团簇都有更明显的分化趋势。正是由于全能干细胞自我更新的特殊要求，现阶段的培养和传代方法很难得到均质性的全能干细胞集落。目前，越来越多的研究证明，全能干细胞集落的均质性对其自我更新和后续分化都具有至关重要的意义。以hESC为例，集落的尺寸和细胞组成对分化诱导因素和全能性维持因素有调节作用，尤其是与集落尺寸直接相关的Smadl信号是由胚胎干细胞和胚胎干细胞衍生的胚胎内胚层细胞的拮抗作用激发的，介导胚胎内胚层细胞的分泌骨形态发生蛋白-2(BMP2)和胚胎干细胞分泌的生长分化因子-3(⑶F3)发生作用。通过单独调控Smadl激活可以拯救胚胎干细胞的自发分化，提示hESC集落的大小可以独立调控干细胞的分化和自我更新，但是在经典培养条件下无法调节集落尺寸大小，在随机的集落尺寸、细胞密度和分子微环境的共同作用下必然存在不可控的自发分化，影响胚胎干细胞的增殖和自我更新。全能干细胞集落的异质性和大小差异对于干细胞的分化命运同样具有重要影响，不可控的初始干细胞集落通常导致不一致或不稳定的分化结果和分化效率，这是全能干细胞分化研究面临的普遍问题。通过微图像化(micropatterning)技术研究发现,尺寸较小的集落向心肌细胞分化的趋势更明显，而尺寸较大的集落向神经细胞分化的趋势更明显全能干细胞培养基底的机械性能对于细胞的自我更新和分化命运也有重要影响。研究证明，基底的弹性模量约为0.6kPa时，对于小鼠胚胎干细胞的自我更新有很好的维持作用，此机械强度与体内组织相似；类似地，在未添加化学信号刺激的条件下，机械强度较高的培养基底具有诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用，而机械强度较低的基底能诱导干细胞向脂肪细胞方向分化；更深入的研究证明合适的机械应力能够抑制hESC的自发分化，并促进其自我更新，当双向循环应力与化学信号协同作用时能调控hESC的自我更新和分化，对于干细胞分化和细胞治疗等领域的研究具有重要意义。因此全能干细胞最理想的培养平台应在维持干细胞显型和核型正常的前提下包含以下三方面的因素:可控的集落形状和尺寸、物理和化学性质可调的培养基底、合适的传代方法已实现可调、稳定的细胞种植密度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种细胞集落体外培养装置。本专利技术所提供的细胞集落体外培养装置包括具有若干微图形空腔的微图形化模板和位于所述微图形化 模板下的粘性水凝胶；所述粘性水凝胶与所述微图形化模板交联粘着为整体，所述粘性水凝胶形成所述微图形空腔的底；所述微图形化模板的每个所述微图形空腔的形状和体积决定细胞集落生长的物理空间。根据需要，所述细胞集落体外培养装置还可包括位于所述粘性水凝胶下的基底，或位于所述粘性水凝胶下并嵌入所述微图形化模板的多孔培养皿。所述粘性水凝胶用可交联形成水凝胶的天然生物材料和/或人工合成生物材料制成，所述天然生物材料选自下述材料中的至少一种:明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白；所述人工合成生物材料选自下述材料中的至少一种:聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯。在本专利技术的实施例中，用作所述微图形化模板的材料具体为聚甲基丙烯酸甲酯；用作所述粘性水凝胶的材料，具体由明胶-甲基丙烯酸甲酯和光引发剂Irgacure2959(12959,2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)组成；所述明胶_甲基丙烯酸甲酯为明胶与甲基丙烯酸甲酯的使用配比为Ig所述明胶比Iml所述甲基丙烯酸甲酯的聚合物。所述明胶-甲基丙烯酸甲酯具体可按照如下方法制备:lg明胶粉末加入IOmL DPBS溶液中，50°C水浴加热，均匀搅拌至完全融化后，以0.5mL/min缓慢加入ImL甲基丙烯酸甲酯，反应2h后取下，待溶液冷却至室温，加入40mL DPBS溶液稀释，用截留分子量8000-12000的透析袋在去离子水中60°C透析I周，离心取上清液冷冻干燥I周，形成白色蓬松泡沫状固体，_80°C保存。所述粘性水凝胶具体可按照包括如下步骤的方本文档来自技高网...
【技术保护点】
细胞集落体外培养装置，包括具有若干微图形空腔的微图形化模板和位于所述微图形化模板下的粘性水凝胶；所述粘性水凝胶与所述微图形化模板交联粘着为整体；所述微图形化模板的每个所述微图形空腔的形状和体积决定细胞集落生长的物理空间。
【技术特征摘要】
1.细胞集落体外培养装置，包括具有若干微图形空腔的微图形化模板和位于所述微图形化模板下的粘性水凝胶；所述粘性水凝胶与所述微图形化模板交联粘着为整体；所述微图形化模板的每个所述微图形空腔的形状和体积决定细胞集落生长的物理空间。2.根据权利要求1所述的细胞集落体外培养装置，其特征在于:所述细胞集落体外培养装置还包括位于所述粘性水凝胶下的基底。3.根据权利要求1所述的细胞集落体外培养装置，其特征在于:所述细胞集落体外培养装置还包括位于所述粘性水凝胶下并嵌入所述微图形化模板的多孔培养皿。4.根据权利要求1-3中任一所述的细胞集落体外培养装置，其特征在于:所述粘性水凝胶用可交联形成水凝胶的天然生物材料和/或人工合成生物材料制成，所述天然生物材料选自下述材料中的至少一种:明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白；所述人工合成生物材料选自下述材料中的至少一种:聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯。5.根据权利要求1-4中任一所述的细胞集落体外培养装置，其特征在于:用作所述微图形化模板的材料为聚甲基丙烯酸甲酯；用作所述粘性水凝胶的材料由明胶-甲基丙烯酸甲酯和光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮组成；所述明胶-甲基丙烯酸甲酯为明胶与甲...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜亚楠，姚睿，王婧宇，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。