本发明专利技术提供一种用于防治物土传病害的多效生防菌剂的制备方法及其应用。采用对作物土传病害病原菌具有拮抗作用的木霉菌株和内生枯草芽胞杆菌为母菌剂，以轻质碳酸钙为载体制成生防菌制剂，该菌剂主要用于防治由镰孢菌、腐霉菌、丝核菌等病原真菌引起的多种作物土传病害，同时具有提高植物自身抗性、增加产量的多重功能。产品生产周期短，防治效果稳定持久，对作物无残留，对环境无污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生防菌剂，特别是一种用于防治作物土传病害的多效复合生防菌剂的制备方法及其应用，所述的两菌株分别为木霉菌(Trichoderma ririofe)和枯草芽胞杆菌{BadIlus subtilis、。
技术介绍
随着越来越多有毒化学农药被限制使用，世界各国都在加大生物农药的研发力度。木霉菌作为一类有重要生防价值的拮抗性真菌，早在20世纪30年代就已经发现对植物病原真菌有拮抗作用，其作用机制包括产生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、竞争作用等。木霉菌强烈的竞争及生存能力在抑制病原菌尤其是土传病害的过程中起着重要作用，是一种很有开发利用价值的生防菌。目前国际上已开发注册有很多木霉菌产品，但由于木霉菌的生防机理所决定的木霉菌只能定殖在植物根表，在施用方式上只能用于作物发病前的预防而一旦发病，病原菌进入植物体内仅靠木霉菌解决不了，尤其对土传类病害的生物防治更是如此，这也在很大程度上制约了木霉菌生物农药的规摸化生产与应用。枯草芽孢杆菌的有关文献记载的是一类普遍存在于土壤中、植物体表和体内的微生物，具有抵抗高温、低温、干燥及营养缺乏等不良环境的优点，有些菌株可在植株体内传导定殖和发挥促生作用，主要抑菌机理是通过产生抗菌物质来抑制病原菌的生长，并能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，与寄主植物建立和谐共生关系。定殖于宿主体内的内生细菌，有充足的营养来源，不易受外界逆境因子影响，与其它根际、叶际生防菌相比，稳定的生存环境更利于其发挥生防的作用。将具有不同生防机理的多种生防菌株复合使用可明显提高防治效果已得到证实。如酵母菌和细菌复合使用可有效防治蔬菜灰霉病、放线菌混合芽孢杆菌防治草莓黄萎病等。将根际定殖的木霉菌与维管束内定殖的内生细菌复配成多功能生物农药尚未见报道。经本实验室多年试验研究发现,枯草芽孢杆菌(ifeci77i/5.subtil is)能抑制许多植物病原真菌菌丝体的正常生长或直接杀灭病菌，对土壤真菌包括镰刀菌、腐霉菌、丝核菌等病原菌引起的多种作物枯萎病、猝倒病、立枯病等有控制作用。通过耐利福平枯草芽胞杆菌突变菌株标记回收和DAS-ELISA等方法对枯草芽胞杆菌在瓜类植株体内的定殖动态进行分析发现，枯草芽胞杆菌可在作物组织内定殖并具有系统运转能力，即随着植物的生长而在体内繁衍，其代谢产物对许多病菌孢子萌发和菌丝生长具有抑制作用，表明代谢产物中存在着抗生素类物质，其代谢物质具较强的热稳定性和酸碱稳定性及对紫外线较强的耐性。利用生防木霉菌与内生性枯草芽孢杆菌防治作物土传病害的不同作用方式及生防机理将两者协同施用，将成为提高作物土传病害防治效果的重要手段，可解决木霉菌生物防治作用不稳定之不足
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于防治农作物土传病害的多效生防菌剂制备方法及其应用，与其它专利技术不同的是，本制剂克服已有技术的不足，根据土传病害的发生特点，通过从作物根表分离出拮抗木霉菌及枯草芽胞杆菌-内生拮抗细菌，将其复配成微生物制剂。本专利技术通过多年大量研究发现大多数拮抗木霉菌具有强烈的竞争生存能力及对土壤中病原菌的重寄生作用，而大多数拮抗枯草芽胞杆菌可在作物组织内定殖并具有系统运转能力，即随着植物的生长而在体内繁衍，其代谢产物对许多病菌孢子萌发和菌丝生长具有抑制作用，利用二者对作物不同生态位点作用方式同时施用具有协同增效作用，可使防治效果达75%以上， 本专利技术的目的是按如下内容实现的: 所采用的生防菌取自于作物根表的木霉菌和内生枯草芽胞杆菌为母菌剂，将其分别纯化后转移至PDA试管斜面内作母菌剂，在三角瓶内振荡培养为二级菌种，再通过液体发酵使其产生抗逆性木霉菌厚垣孢子和枯草芽胞杆菌孢子，将载有大量孢子的发酵产物与载体混合后制成多效复合生防制剂。所述多效复合生防菌剂按如下方法制备而成: A:斜面母菌种的制备: 取作物根表土壤10克，加无菌水稀释至1000毫升稀释液，将稀释液与PDA培养基按I: 9的重量比例混合后倒入培养皿内制成平板，26°C下培养48小时，经分离获得木霉菌；纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种； PDA培养基:马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、孟加拉红0.05克、硫酸链霉素 0.03克、水1000毫升； 取作物根系10克，用0.1%升汞溶液表面消毒2-4分钟后，再以无菌水冲洗3-5次后研碎，加无菌水稀释至1000毫升稀释液，将稀释液与PDA培养基按1: 9的重量比例混合后倒入培养皿内制成平板，26°C下培养48小时，经分离获得内生枯草芽胞杆菌；纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种； PDA培养基:马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、7K 1000毫升； B: 二级菌种的制备: 二级菌种培养液为红糖20-30克，酵母2-5克，调pH值为7-9，加水至1000毫升。分装在250毫升三角瓶中，装液量为100毫升，在121°C下灭菌30分钟，接入斜面母菌种，摇床转速为150-200转/分，发酵温度28-30°C，发酵时间为2_3天； C:液体发酵: 制备木霉菌厚垣孢子: 培养基配方为:马铃薯150 - 200克，葡萄糖15 - 20克，磷酸二氢钾I 一 2克，硫酸镁I — 2克，硫酸钙I — 2克，色氨酸3 — 5克，果糖2 — 4克，水1000毫升:调pH值为5 —6.5，121°C下灭菌30-40分钟，接菌量为培养基重量的2 — 4%，发酵温度为23 — 25°C，搅拌速度为120-150rpm，发酵时间3 — 5天，得到木霉菌厚垣孢子悬浮液； 制备枯草芽胞杆菌孢子: 培养基配方为:牛肉膏2-4克g、蛋白胨5-10克、酵母膏2-5克、蔗糖10-20克、磷酸二氢钾I 一 2克，硫酸镁I 一 2克、水1000毫升；调PH值为7-8，121°C下灭菌30-40分钟，接菌量为培养基重量的2 - 4%，发酵温度为28-30°C，搅拌速度为120-150rpm，发酵时间3 - 5天，得到枯草芽胞杆菌孢子悬浮液； D:生防菌剂的制备:将所得木霉菌厚垣孢子悬浮液按重量比例8-10%、内生枯草芽胞杆菌孢子悬浮液按重量比例10-12%与轻质碳酸I丐按重量比例20-30%和娃藻土按重量比例50 - 60%充分混合后制成生防制剂。将多效复合生防菌剂与土或水按重量比例1:100-300混合，采用床面拌土或穴施或灌根的方法防治作物土传病害。本专利技术的优点在于: 1.本专利技术绿色木霉菌厚垣孢子作为一种抗逆类型的孢子形态，与内生芽孢杆菌的芽孢一样具有抵抗高温、低温、干燥及营养缺乏等不良环境的能力。将两孢子用灭菌硅藻土吸附并制成制剂，于室温下保藏2年，孢子仍然能够萌发。通过人工培养后又放归于自然，并使之在自然微生物区系中进一步繁衍，形成有益微生物在土壤中的良性循环，有利于保持根际微生态的自然平衡，达到对病害的持续控制。2.内生芽孢杆菌繁殖速度极快，在作物根表形成生物屏障阻止病原菌侵染，同时附着在根系的芽孢杆菌在土壤和根表分泌抗生物质有效地抑制了病菌孢子的萌发，进入植株体内的芽孢杆菌可通过传导抑制和杀死病菌。3.木霉菌可在根表定殖，通过与病原菌竞争营养及占领生态位点等发挥生防作用，枯草芽孢杆菌可在植物体内运转，抑制及杀死进入植株体内的病原菌，两类生防菌分别在根表与根内形成了双重生态屏障。4.引本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多效复合生防菌剂的制备方法，其特征在于包括如下具体步骤：(1)斜面母菌种的制备：取作物根表土壤10克，加无菌水稀释至1000毫升稀释液，将稀释液与PDA培养基按1∶9的重量比例混合后倒入培养皿内制成平板，26℃下培养48小时，经分离获得木霉菌；纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种；PDA培养基：马铃薯200克、葡萄糖20?克、琼脂20克、孟加拉红0.05克、硫酸链霉素0.03克、水1000毫升；取作物根系10克，用0.1%升汞溶液表面消毒2?4分钟后，再以无菌水冲洗3?5次后研碎，加无菌水稀释至1000毫升稀释液，将稀释液与PDA培养基按1∶9的重量比例混合后倒入培养皿内制成平板，26℃下培养48小时，经分离获得内生枯草芽胞杆菌；纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种；PDA培养基：马铃薯200克、葡萄糖20?克、琼脂20克、水1000毫升；(2)二级菌种的制备：二级菌种培养液为红糖20?30克，酵母2?5克，调pH值为7?9，加水至1000毫升。分装在250毫升三角瓶中，装液量为100毫升，在121℃下灭菌30分钟，接入斜面母菌种，摇床转速为150?200转/分，发酵温度28?30℃，发酵时间为2?3天；??(3)液体发酵：制备木霉菌厚垣孢子：培养基配方为：马铃薯150－200克，葡萄糖15－20克，磷酸二氢钾1－2克，硫酸镁1－2克，硫酸钙1－2克，色氨酸3－5克，果糖2－4克，水1000毫升；调pH值为5－6.5，121℃下灭菌30?40分钟，接菌量为培养基重量的2－4％，发酵温度为23－25℃，搅拌速度为120?150rpm?，发酵时间3－5天，得到木霉菌厚垣孢子悬浮液；制备枯草芽胞杆菌孢子：培养基配方为：牛肉膏2?4克g、蛋白胨5?10克、酵母膏2?5克、蔗糖10?20克、磷酸二氢钾1－2克，硫酸镁1－2克、水1000毫升；调PH值为7?8，121℃下灭菌30?40分钟，接菌量为培养基重量的2－4％，发酵温度为28?30℃，搅拌速度为120?150rpm?，发酵时间3－5天，得到枯草芽胞杆菌孢子悬浮液；(4)生防菌剂的制备：将所得木霉菌厚垣孢悬浮液子按重量比例8?10％、枯草芽胞杆菌孢子悬浮液按重量比例10?12％与轻质碳酸钙按重量比例20?30％和硅藻土按重量比例50－60％充分混合后制成生防制剂。...
【技术特征摘要】
1.一种多效复合生防菌剂的制备方法，其特征在于包括如下具体步骤: (1)斜面母菌种的制备: 取作物根表土壤10克，加无菌水稀释至1000毫升稀释液，将稀释液与PDA培养基按I: 9的重量比例混合后倒入培养皿内制成平板，26°C下培养48小时，经分离获得木霉菌；纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种； PDA培养基:马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、孟加拉红0.05克、硫酸链霉素0.03克、水1000毫升； 取作物根系10克，用0.1%升汞溶液表面消毒2-4分钟后，再以无菌水冲洗3-5次后研碎，加无菌水稀释至1000毫升稀释液，将稀释液与PDA培养基按1: 9的重量比例混合后倒入培养皿内制成平板，26°C下培养48小时，经分离获得内生枯草芽胞杆菌；纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种； PDA培养基:马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、7K 1000毫升； (2)二级菌种的制备: 二级菌种培养液为红糖20-30克，酵母2-5克，调pH值为7-9，加水至1000毫升。分装在250毫升三角瓶中，装液量为100毫升，在121°C下灭菌30分钟，接入斜面母菌种，摇床转速为150-200转/ 分，发酵温度28-30°C，发酵时间为2_3天； (3)液体发酵: 制备木霉菌厚垣孢子: ...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑雅楠，杨长成，魏汉莲，高增贵，李可强，关昕，庄敬华，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：
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