本发明专利技术包括多杀菌素生物合成基因、用生物合成基因转化的产生多杀菌素的微生物、使用生物合成基因提高多杀菌素杀昆虫大环内酯的产生的方法，和使用基因或基因片段改变由产生多杀菌素的微生物产生的产物的方法。另外，本发明专利技术包括将产生多杀菌素A和D的菌株转化成产生乙基多杀菌素前体多杀菌素J和L的菌株的方法和组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及破坏基因表达的分子遗传学的
更具体地，已经发现，在spnK基因中的突变将产生多杀菌素(Spinosad)的菌株转化成产生乙基多杀菌素(spinetoram)前体的菌株。
技术介绍
如美国专利5，362，634中所披露，发酵产物A83543是由刺糖多孢菌(SaccharopolySpora spinosa)产生的相关化合物的家族。已将该家族的已知成员称为因子或组分，并且各自给予标识字母代号。将这些化合物在下文中称为多杀菌素A、B等。多杀菌素化合物可用于控制蜘蛛、线虫和昆虫，具体地，鳞翅目(I^pidoptera)和双翅目(Diptera)物种，它们在环境上相当友好并且具有吸引人的毒理学特征。天然产生的多杀菌素化合物由以下物质组成与12元大环内酯稠合的5，6，5-三环环系、中性糖(鼠李糖)和氨基糖(forosamine)(见Kirst等人(1991))。如果氨基糖不存在，则将所述化合物称为A、D等的拟甙元，以及如果中性糖不存在，则将所述化合物称为A、D等的反拟甙元。更优选的命名是将拟甙元称为多杀菌素A17-Psa、多杀菌素D17-Psa等，以及将反拟甙元称为多杀菌素A9_Psa、多杀菌素D9_Psa等。天然产生的多杀菌素化合物可由培养物NRRL18395、18537、18538、18539、18719、18720、18743和18823经发酵产生。这些培养物已经进行保藏，并成为美国北方农业研究所保藏中心(the Midwest Area Northern Regional Research Center, AgriculturalResearch Service,United States Department of Agriculture, 1815North UniversityStreet, Peoria, 111.，61604)的储备培养物收集的一部分。美国专利5，362，634和相应的欧洲专利申请375316A1涉及多杀菌素A、B、C、D、E、F、G、H和J。这些化合物据说通过培养选自NRRL18395、NRRL18537、NRRL18538和NRRL18539的新型微生物刺糖多孢菌的菌株产生。1093/09126涉及多杀菌素1^、]\1、队0、1 、3和1'。其中还讨论了两种产生多杀菌素J的菌株:NRRL18719和NRRL18720，和产生多杀菌素Q、R、S和T的菌株:NRRL18823。W094/20518和美国专利5，6704, 486涉及多杀菌素K、O、P、U、V、W和Y，及其衍生物。还讨论了产生多杀菌素K的菌株NRRL18743。产生多杀菌素化合物的挑战来自以下事实:需要非常大的发酵体积产生非常少量的多杀菌素。闻度希望提闻多杀菌素广生效率并由此提闻多杀菌素实用性，同时降低成本。还有利的是提供克隆的生物合成基因，所述克隆的生物合成基因提供产生新的可具有不同杀昆虫活性范围的多杀菌素衍生物的方法。新衍生物是需要的，因为尽管已知多杀菌素抑制广谱的昆虫，但是它们不控制全部害虫。不同的控制模式(patterns ofcontrol)可通过多杀菌素的生物合成中间体,或者通过它们在体内产生的衍生物，或者通过它们的体外化学修饰得到的衍生物提供。还有利的是提供通过刺糖多孢菌的突变菌株合成的新型中间体，其中编码多杀菌素生物合成酶的某些基因的一些部分被已经进行体外特异性突变的相同基因的一些部分代替，或者被来自其它有机体的基因的相应部分代替。
技术实现思路
本专利技术提供将广生多杀菌素的菌株如多杀菌素A和D转化成广生乙基多杀菌素前体的菌株如多杀菌素J和L的方法。这种方法可包括在spnK基因中进行修饰，以消除3' -O-甲基转移酶活性。所述修饰可通过符合读框的缺失、突变、取代、删除、插入等进行。所述符合读框的缺失可在整个基因内进行，包括删除5'端、3'端或编码spnK的区域。一个这种符合读框的缺失可包括SEQ.1D.N0.9。点突变可包括但不限于在以下位置的突变:碱基对 528、589、602、668、721、794、862、895、908、937 和 1131。这些突变可在 spnK 基因的翻译中导致变化。这种 变化可为氨基酸变化、取代或产生终止密码子。与多杀菌素A和D相比，这种修饰导致多杀菌素J和L的多杀菌素化合物产生。本专利技术的具体方法包括通过使spnK基因失效(disabling)同时维持多杀菌素J和L广生而将广生多杀菌素的菌株转化成广生乙基多杀菌素如体的菌株。正常spnK蛋白活性的失效或破坏可通过符合读框的缺失、突变、取代、删除、插入等进行。它也可通过操作启动子或核糖体结合位点序列实现。本专利技术还提供产生乙基多杀菌素前体的遗传修饰的宿主细胞。这种遗传修饰的宿主可通过以下方法产生:修饰spnK基因以消除3' -O-甲基转移酶活性。所述修饰可通过符合读框的缺失、突变、取代、删除、插入等进行。符合读框的缺失可包括删除5'端、3'端或删除编码spnK的区域。通过修饰spnK基因以消除3' -O-甲基转移酶活性，本专利技术还提供将产生多杀菌素的菌株转化成产生多杀菌素前体的菌株的方法。这种方法可包括符合读框的缺失、点突变、删除和插入。这种符合读框的缺失可包括符合读框的缺失5'端，符合读框的缺失3'端和符合读框的缺失编码spnK的区域。删除可包括破坏spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除。插入可包括破坏spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基插入。点突变可发生在碱基对位置528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131处。这些点突变可在spnK基因的活性位点或底物结合位点处导致氨基酸取代。本专利技术还包括通过在spnK基因中产生修饰以消除3' -O-甲基转移酶活性而产生乙基多杀菌素前体的遗传修饰的宿主细胞，其中所述遗传修饰的宿主细胞为通常不产生大量乙基多杀菌素前体的原核宿主细胞。其它实施方案包括通过使spnK基因失效同时维持多杀菌素J和L产生而将产生多杀菌素的菌株转化成产生乙基多杀菌素前体的菌株的方法。这种方法可包括符合读框的缺失、点突变、删除和插入。所述符合读框的缺失可包括符合读框的缺失5'端，符合读框的缺失3'端和符合读框的缺失编码spnK的区域。所述删除可包括破坏spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除。插入可包括破坏spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基插入。点突变可发生在碱基对位置528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131处。这些点突变可在spnK基因的活性位点或底物结合位点处导致氨基酸取代。使spnK失效的其它方法可通过操作核糖体结合位点或者通过操作spnK基因的启动子实施。附图说明图1示出spnK点突变的位置。突变在spnK的野生型序列(SEQ ID NO: 17)中突出显示。图2示出spnJ、spnK、spnL和spnM的物理图谱。产生的PCR产物通过线在染色体图下面指出。图3示出根据本专利技术实施方案作为单交换同源重组将spnK符合读框的缺失构建体整合在spnLM区域中。(星号指出spnj和spnM的不完全编码序列)。图4示出根据本专利技术实施方案的双交换突变物，其导致s本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩蕾，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：
国别省市：
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