一种测定重组腺相关病毒滴度的定量PCR方法技术

本发明专利技术涉及一种实时荧光定量PCR检测重组腺相关病毒（rAAV）滴度的方法，通过分析AAV的空间构象，确定可能影响其检测的空间构象位置及消除方法，本发明专利技术比传统的方法能够显著提高重组腺相关病毒滴度检测的准确度，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

:本专利技术涉及定量实时荧光PCR检测重组腺相关病毒滴度的方法。
技术介绍
:腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)载体是含有单链的DNA,无包膜,属于依赖辅助病毒的细小病毒B19家族。这种病毒是1965年Atchison等人在猿猴腺病毒15(SV-15)中发现并定义为腺相关病毒(AAV)。AAV在宿主中的复制需要宿主细胞或其他病毒的协助才能完成，如腺病毒和疱疹病毒，也因此被称为腺相关病毒。AAV病毒颗粒直经大约20nm，呈二十面体，分子量约为5.5-6.2 X IO6道尔顿，在CsCl梯度中的密度为1.39-1.42g/cm。相较于其它病毒，腺相关病毒更加稳定，可以承受60度的温度及离子去污剂的作用。AAV基因组为线性单链的正链或负链DNA，长度约为4700个核苷酸。腺相关病毒的基因组中含有两个开放的阅读框，rep和cap，两端分别有末端重复序列(ITR)。重组腺相关病毒(rAAV)载体因其在体内外表达效率高、表达周期长、免疫性低、无致病和致瘤性、遗传毒性低并可规模化生产等诸多优点，使其成为目前基因治疗领域非常有前途的生物载体，现已被广泛应用于临床试验且取得很好的疗效。然而，迄今世界上还没有形成统一的标准化的AAV滴度测定和临床剂量使用标准，给不同实验室临床试验结果间的比较造成了困难。目前国际基因治疗中应用较多的另一种腺病毒，已由腺病毒标准样品工作小组(Adenovirus Reference Material WorkingGroup, ARMWG)根据5型腺病毒制定出标准样品指南。其对腺病毒的滴度测定和基因治疗中使用的剂量进行了统一规定。 参照这一经验，美国食品药品监督管理局(FDA)、美国国家健康研究所重组DNA顾问委员会(NIH-RAC)、美国国家基因载体实验室和来自其他9个国家的科学家共同成立了 AAV标准样品工作小组(AAV Reference Standard Working Group,AAVRSffG),试图建立起AAV的标准化指南。rAAV2是基因治疗领域应用最早和最广泛的亚型，也是目前物理、化学和生物性质研究得最清楚的AAV亚型。所以标准化指南首先建立在rAAV2的基础上。该组织对rAAV2标准样品统一测定时，要求被测定的rAAV2标准样品，必须要达到在不同实验室能进行不同测定所需的量，并具有一定时间内的稳定性。同时，规定了生产和纯化rAAV2的标准指南。该组织确定，选择四个方面进行测定实施对rAAV2的质量控制:(I)使用A20酶联免疫吸附法测定rAAV2外壳滴度；(2)定量聚合酶链反应qPCR测定rAAV2的基因组滴度；(3) qPCR和增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达测定感染滴度；(4)SDS-PAGE测定病毒纯化和外壳蛋白。如所周知，rAAV的滴度是影响基因治疗效果的重要因素。研究发现，临床试验对病毒生产的要求为IO3和105DRP/cell (DNA酶-抗性颗粒/细胞，DNase-ResistantParticles/cell)。而临床试验中的剂量一般为2X 10nDRP/kg，需要的单批产量约为1015DRP。而且不同组织对rAAV的使用滴度要求有所不同。在眼科临床试验中，大约只需要2X IO8DRP,而对肌肉或者肝脏疾病进行治疗时却需要1X1014DRP。目前涉及rAAV应用于临床试验的研究有81项。多数临床研究处于临床I期和II期，但是有8项临床研究已经进入III期。临床结果表明，基因表达量与rAAV的滴度成正比关系，而且大多数基因药物的疗效与表达量有很大关系，表达量太低达不到其起作用的药物需求量。某些基因药物高表达可能会导致正常功能的紊乱，从而对人体产生伤害。研究发现，rAAV对于某些病人会产生针对其外壳蛋白的免疫反应，包括抗原特异性记忆性CD8+T细胞、抗体和干扰素等。所以，rAAV的滴度测定对临床试验至关重要。而整个基因治疗领域制定标准化的滴度测定方法，将使不同实验室间临床结果比较和药物研发成为可能。目前测定rAAV滴度的方法主要检测以下几个方面:病毒颗粒滴度(Viral Particles, V.P.),基因组滴度(viral genome,V.G.),感染滴度(Infectious Particles, 1.P.),转导滴度(Transduction Units, T.U.)或增强的转导滴度(Enhanced Transduction Units, E.T.U.)。重组单链腺相关病毒ssAAV2基因组由两个末端反向重复序列(ITR)包含CAG启动子、目的基因cDNA、土拨鼠肝炎病毒后调控兀件(woodchuck hepatitisB viruspost-regulatory element, WPRE)> 牛生长激素 polyA 兀件(bovine growth hormonepolyadenylation signal, poly A BGH)构成。双链互补腺相关病毒scrAAV2基因组因为含有两条互补的链，其中一半基因组的序列由末端ITR、牛生长激素polyA元件、目的基因cDNA和CB启动子组成，另一半是上述基因组的反向互补序列，中间由缺失了末端断裂位点(TRS)的ITR连接。重组ssAAV2和scAAV2_cDNA结构如附图说明图1所示。分别将ssrAAV2和scrAAV2的全基因组序列通过在线DNA构象分析网站进行生物信息学分析(http://mfold.rna.albany.edu/ q=mfold/DNA-Folding-Form),显不野生型的AAV2基因组主要有两种可能的构象。其中一种主要构象中，两段ITR形成反向互补的发卡结构，而其他部分形成松散的DNA构象展开。另一种主要构象为两段ITR相互之间形成反向互补的构象，从而使ITR之间的序列结合在一起，形成一种松散的互补性结构。从野生型的两种主要构象中可以看到，ITR对AAV2基因组构象的影响非常大，ITR特殊的构象会导致整个AAV2基因组的构象发生变化。重组ssAAV2-cDNA基因组的构象分析表明，虽然只有ITR与野生型AAV2基因组相同，中间的序列都不相同，但是基因组的构象与野生型基因组极为相似。表明在重组ssAAV2中，其他序列对基因组构象形成所起的作用有限，两段ITR所具有的反向重复序列，在单链AAV2的基因组构象形成中起到至关重要的作用。重组scAAV2-cDNA的基因组构象分析表明，在其基因组主要受到中间突变ITR的影响，其他自身互补性序列形成非常紧密的互补结构。虽然末端的两个ITR会形成不同的构象，但是对整体的构象影响不大。通过对重组腺病毒载体构象分析发`现，可能因其基因组上ITR的特殊构象导致qPCR的检测结果偏低。而ITR存在于所有腺相关病毒AAV中，为消除AAV结构ITR特殊构象对qPCR检测滴度的影响，以增加其测定准确性方法的研究，迄今尚未见有相关报道。本专利技术目的在于提供一种能准确反映所测定重组腺相关病毒滴度的定量PCR方法
技术实现思路
:本专利技术首先以AAV2为例，研究证明AAV2空间构象对定量PCR (qPCR)检测的影响。为此，使用靶向不同元件CAG、cDNA、WPRE、pBGH的引物对重组ssAAV2基因组，或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测重组腺相关病毒滴度的定量PCR方法，其特征是，所述方法系利用腺相关病毒基因组共有的空间构象末端重复序列ITR中的SmaI限制性酶切位点，通过SmaI酶切，消除影响定量PCR检测重组腺相关病毒滴度的干扰，再以酶切后的重组腺相关病毒DNA为模板进行实时定量PCR检测，具体实施步骤包括：1）将重组腺相关病毒感染细胞，扩增制备重组腺相关病毒；2）提取纯化重组腺相关病毒DNA；3）用SmaI酶切处理腺相关病毒DNA，破坏ITR的构象；4）以酶切后的重组腺相关病毒DNA为模板，用不同元件设计引物进行实时定量PCR检测重组腺相关病毒的滴度。

【技术特征摘要】
1.一种检测重组腺相关病毒滴度的定量PCR方法，其特征是，所述方法系利用腺相关病毒基因组共有的空间构象末端重复序列ITR中的SmaI限制性酶切位点，通过SmaI酶切，消除影响定量PCR检测重组腺相关病毒滴度的干扰，再以酶切后的重组腺相关病毒DNA为模板进行实时定量PCR检测，具体...

【专利技术属性】
技术研发人员：许瑞安，王峰，崔秀灵，
申请(专利权)人：许瑞安，
类型：发明
国别省市：