本发明专利技术涉及生物制药领域，具体讲，涉及一种重组人粒细胞集落刺激生长因子用微生物筛选而制备的方法。所述的制备方法的步骤为：选用重组人粒细胞集落刺激因子的工程菌进行发酵培养；对发酵培养基所得菌体进行超声破碎，收集包涵体，用包涵体洗涤液进行洗涤后低温离心；包涵体中加入包涵体溶解液，4℃条件下8～12小时后，离心得到包涵体提取液；采用SephacrylS-200凝胶柱对提取液进行分离，收集复性的重组人粒细胞集落刺激因子馏分；再采用SephadexG25柱进行分离，得到人重组人细胞集落刺激因子。本发明专利技术还涉及该重组人粒细胞集落刺激因子的药物组合物及制剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药领域，具体讲，涉及一种重组人粒细胞集落刺激生长因子用微生物筛选而制备的方法，其药物组合物及制剂。
技术介绍
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，含有174个氨基酸，分子量约为20000。主要由内毒素、TNF-α和IFN-Y可活化单核细胞和巨噬细胞产生。G-CSF基因全长2.5kb，包括5个外显子和4个内含子，G-CSF有5个半胱氨酸，Cys36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫键，Cysl7为不配对半胱氨酸，二硫键对于维持G-CSF生物学功能是必须的因素。人和小鼠G-CSF在氨基酸水平上有73%同源性，并具有相互交叉的生物学活性。G-CSF主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。临床主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓 造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。人粒细胞集落刺激生长因子是一种造血生长因子，它在刺激增殖、分化和活化血细胞的功能等方面具有重要的作用；其分子在17位包含一个自由半胱氨酸，并含有两对二硫键，即Cys36-Cys42和Cys64-Cys74，这两对二硫键对于其活性是必须的；然而，hG_CSF的来源是非常有限的，因此在工业中，必须用基因工程的方法来生产它。通常在E.coli中表达重组hG-CSF(rhG-CSF)，它以不溶于水的包涵体的形式存在，因此必须用高浓度的变性剂溶解，这样溶解得到的蛋白是以去折叠状态存在的，必须对其进行复性，然后采用多步色谱步骤对其进行纯化，但其质量回收率不到20%。为此，本专利技术提出了一种回收率高、生物活性高的重组人粒细胞集落刺激生长因子的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提出了一种重组人粒细胞集落刺激生长因子用微生物筛选而制备的方法。为了实现本专利技术的目的，采用的技术方案为:—种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的步骤为:(I)将重组人粒细胞集落刺激因子的工程菌进行发酵培养；(2)对发酵培养基所得菌体进行超声破碎，收集包涵体，用包涵体洗涤液进行洗涤后低温离心；(3)包涵体中加入包涵体溶解液，4°C条件下8 12小时后,离心得到包涵体提取液；(4)在2 8°C条件下,采用SephacrylS-200凝胶柱对提取液进行分离,收集复性的重组人粒细胞集落刺激因子馏分；(5)再采用S印hadexG25柱进行分离，得到人重组人细胞集落刺激因子。本专利技术的第一优选技术方案为:在步骤(2)中，将收集的菌体用TE缓冲液洗涤I 3次，然后采用超声破碎0.5 I小时，低温离心，收集包涵体；再加入包涵体洗涤液，O 4°C条件下混合20 60分钟，低温离心。本专利技术的第二优选技术方案为:在步骤(2)中，所述的TE缓冲液为:20mmol/LTris-HCl+lmmol/L EDTA, ρΗ8.0 ;包涵体洗涤液为:20mmol/L Tris-HCl+lmmol/LEDTA+2mmol/L脲+0.5%Tritonx-100, pH8.0 ;包涵体重量与包涵体洗涤液的体积比为1:10 20，优选 I =IO0本专利技术的第三优选技术方案为:在步骤(3)中，所述的包涵体溶解液为:20mmol/LTris-HCl+lmmol/L EDTA+7mmol/L 盐酸胍+20mmol/L DTT, ρΗ8.0 ;包涵体质量与包涵体溶解液的体积之比为:1:5 10，优选1:10。本专利技术的第四优选技术方案为:在步骤(4)中，所述的色谱条件为:流动相为:0.15mol/L NaCl+0.05mol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA+2mmol/L 脲+0.8mmol/LGSH+0.2mmol/L GSSG, pH7.8 ；流速为2mL/min ；检验波长为280nm。本专利技术的第五优选技术方案为:在步骤(4)中，所述的SuperdeX75凝胶柱先用流动相平衡，然后进样对包涵体提取液进行分离。本专利技术的第六优选技术方案为:在步骤(5)中，将收集的复性的人重组粒细胞集落刺激因子馏分用10%的冰醋酸调节至pH为4.0 4.5，优选pH为4.2 ;低温离心20 40分钟得上清液，上清液上SephadeXG25柱，用洗脱液洗脱，收集主峰进行分离，得到人重组人细胞集落刺激因子。本专利技术的第七优选技术方案为:在步骤(5)中，所述的S印hadexG25柱先采用pH为4.0 4.5的20mmol/L的醋酸钠平衡，优选为pH为4.2。本专利技术的第八优选技术方案为:在步骤(5)中，所述的洗脱液为:10mmol/L的氯化钠+15mmol/L的醋酸钠，pH为4.4。本专利技术还涉及一种由本专利技术的制备方法制备得到的重组人粒细胞集落刺激因子的药物组合物，所述的药物组合物的组成为:重组人粒细胞集落刺激因子100重量份，甘露醇5 100重量份。所述的药物组合物的剂型为冻干粉针或水针；其中，当所述的剂型为水针时，药物组合物的组成为重组人粒细胞集落刺激因子100重量份，甘露醇5 10重量份；当所述的剂型为冻干粉针时，药物组合物的组成为重组人粒细胞集落刺激因子100重量份，甘露醇50 100重量份。下面对本专利技术的技术方案做进一步的解释和说明。本专利技术的采用凝胶色谱柱对重组人粒细胞集落刺激因子的发酵培养物进行处理，通过对色谱条件的精细控制，使通过步骤4得到的hG-GSF的质量回收率达到48.9%，比活为4.4X 108IU/mg，纯度为89.6%。经过步骤5进行进一步的纯化，其纯度可达99.75%，步骤5的回收率为96.3%, hG-GSF的比活为4.3X 108IU/mg。本专利技术的制备方法其总质量回收率可达46.8%,纯度达到99.75%,比活为4.3X 108IU/mg。本专利技术还涉及重组人粒细胞集落刺激因子的药物组合物，并且该药物组合物可制备成多种剂型。在该药物组合物中，可以添加适量的赋形剂、稳定剂等添加剂。本专利技术中选用了效果较好的甘露醇。其中药物辅料的选择以及制备方法可选用常规方法制备。规格可按照市场的需要，制备成50 μ g/支、100 μ g/支、150 μ g/支、300 μ g/支等不同的规格。本专利技术的制备方法克服了现有技术中重组人粒细胞集落刺激因子生物发酵方法制备过程中产率低的技术难题，并且适用于大规模的工业生产。本专利技术的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本专利技术，并不对本专利技术的内容构成限制。具体实施例方式实施例1制备重组人粒细胞集落刺激因子:1.选用工程菌DH5 a _PBV220_hGCSF菌株进行发酵培养；2.将收集的菌体用TE缓冲液洗涤3次，然后采用超声破碎0.5 I小时，低温离心，收集包涵体；再加入包涵体洗涤液，4°C条件下混合30分钟，4°C低温离心；TE缓冲液为:20mmol/LTris-HCl+lmmol/L EDTA, ρΗ8.0 ;包涵体洗漆液为:20mmol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA+2mm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的步骤为：（1）选用重组人粒细胞集落刺激因子的工程菌进行发酵培养；（2）对发酵培养基所得菌体进行超声破碎，收集包涵体，用包涵体洗涤液进行洗涤后低温离心；（3）包涵体中加入包涵体溶解液，4℃条件下8～12小时后，离心得到包涵体提取液；（4）在2～8℃条件下，采用SephacrylS?200凝胶柱对提取液进行分离，收集复性的重组人粒细胞集落刺激因子馏分；（5）再采用SephadexG25柱进行分离，得到人重组人细胞集落刺激因子。
【技术特征摘要】
1.一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的步骤为: (1)选用重组人粒细胞集落刺激因子的工程菌进行发酵培养； (2)对发酵培养基所得菌体进行超声破碎，收集包涵体，用包涵体洗涤液进行洗涤后低温尚心； (3)包涵体中加入包涵体溶解液，4°C条件下8 12小时后,离心得到包涵体提取液； (4)在2 8°C条件下,采用SephacrylS-200凝胶柱对提取液进行分离,收集复性的重组人粒细胞集落刺激因子馏分； (5)再采用SephadexG25柱进行分离，得到人重组人细胞集落刺激因子。2.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将收集的菌体用TE缓冲液洗涤I 3次，然后采用超声破碎0.5 I小时，低温离心,收集包涵体；再加入包涵体洗涤液，O 4°C条件下混合20 60分钟，低温离心。3.根据权利要求2所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的TE缓冲液为:20mmol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA, ρΗ8.0 ;包涵体洗涤液为:20mmol/LTris-HCl+lmmol/L EDTA+2mmol/L 脲 +0.5%Tritonx-100, ρΗ8.0 ;包涵体重量与包涵体洗涤液的体积比为1:10 20，优选1:10。4.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述的包涵体溶解液为:20mmol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA+7mmol/L盐酸胍+20mmol/L DTT, ρΗ8.0 ;包涵体质量与包涵体溶解液的体积之比为:1:5 10，优选1:10。5.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗诚，
申请(专利权)人：罗诚，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。