本发明专利技术属于生物医药领域，涉及复合干扰素半胱氨酸突变体、其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法、药物组合物和两者在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。所述的复合干扰素半胱氨酸突变体是将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第75位的氨基酸突变为半胱氨酸；所述的复合干扰素半胱氨酸突变体的聚乙二醇衍生物是由所述的复合干扰素半胱氨酸突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa-40KDa之间。本发明专利技术的复合干扰素半胱氨酸突变体及其聚乙二醇衍生物有更高的生物学活性，更好的药理作用与稳定性，并具有更可靠的安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术一般的涉及干扰素α突变体、其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法、药物组合物和两者在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途，特别的涉及复合干扰素半胱氨酸突变体、其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法、药物组合物和两者在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
技术介绍
干扰素(interferon，IFN)是一种最初由动物机体产生的具有广谱抗病毒作用的细胞因子类药物，根据其产生部位与作用机理不同可以分为α、β、Y、λ等大的类型，而每种大的类型又可分为若干小的亚型，同一大的类型中不同的亚型间在一级结构上差异很小，在二级以上高级结构上非常接近。在几种大的类型中，α型是应用最广的一种，目前临床应用的此型干扰素主要包括干扰素a 2a、干扰素a 2b、干扰素a lb、复合干扰素等。其中复合干扰素(consensus interferon或integrated interferon)是在对已知的α型干扰素进行序列比对后，把出现频率最高的氨基酸分配到各自相应的位置，并对个别位置进行修改后得到的非天然氨基酸序列的人工设计α型干扰素，包括多种氨基酸序列的分子，但彼此间同源性高，它们的生物学活性为天然α型干扰素的10倍以上。虽然各种α型干扰素在当前治疗病毒性感染疾病的过程中发挥着越来越广泛的疗效，但是其自身稳定性差、半衰期短的特点也限制了其进一步的临床推广应用，给病人用药带来了一些麻烦。鉴于此原 因，国内外开展了很多长效干扰素方面的基础研究与产品开发，包括对干扰素分子自身进行改造、研发包括干扰素分子氨基酸序列的融合蛋白、对干扰素分子进行化学修饰、选择适宜的药物输送体系优化干扰素分子的体内输送与药效发挥过程等，其中聚乙二醇修饰干扰素(属于化学修饰的干扰素)的上市是在这一领域取得的最大成功。聚乙二醇(polyethelene glycol, PEG)是一种线性高分子化合物，由于其良好的生物相容性和既亲水又亲酯的双亲特性，得以从众多的化学修饰剂中脱颖而出成为目前研究与应用最广的蛋白多肽类药物的修饰剂。经过多年的研究开发，目前已有两个PEG修饰的干扰素α产品成功上市，分别是美国先灵葆雅(Schering-Plough)公司(现已被默沙东公司收购)的PEG修饰的干扰素a2b (商品名为“佩乐能”)和瑞士罗氏(Roche)公司的PEG修饰的干扰素a2a (商品名为“派罗欣”)，分别于2001年和2002年在美国上市，在2003年同时进入中国内地销售。关于先灵葆雅公司的PEG修饰的干扰素a2b，在中国专利申请CN00808452.1中对其配方组成有所描述；而罗氏公司的PEG修饰的干扰素a 2a则在中国专利CN97113049.3中有详细描述。除此之外，还有更多的PEG修饰的干扰素α产品正在研究开发中，其中最接近上市阶段的是Intermune公司开发的PEG修饰的复合干扰素。纵观PEG修饰干扰素α技术的发展，主要是伴随着PEG修饰技术的发展。早期的研究和开发主要围绕非特异性位点PEG修饰技术，所选用的PEG修饰剂纯度低、分子量小(一般在IOKDa以下)且分布范围宽、修饰位点种类和数量多且形成的修饰衍生物不稳定，造成修饰产物组成不均一、纯度相对较低(85%左右)、质量控制不易实现、长效作用不明显且仍有一定的毒副作用。上述先灵葆雅公司的PEG修饰的干扰素a 2b产品就属于此类型。伴随着PEG修饰剂的发展出现了特异性位点PEG修饰技术，由于所选用的PEG修饰剂的纯度得到了很大提高，分子量可达20KDa以上且分布范围大幅缩窄，且修饰机理的改善使修饰位点种类和数量减少，形成的修饰衍生物稳定性提高，从而使上述非特异性位点PEG修饰技术的缺点得到了很大程度的改善。特异性位点PEG修饰技术又可分为三种类型，一种是用具有分支结构的PEG修饰剂修饰目标蛋白分子，借助分支结构PEG修饰剂较强的空间位阻效应达到减少修饰位点数量的目的。上述罗氏公司的PEG修饰的干扰素a2a产品就属于此类型。但是由于这种所谓的“特异性位点”修饰技术从修饰机理上既不能做到只修饰单一种类的氨基酸，也不能做到只修饰单一位点的氨基酸，所以修饰位点的种类与数目依然众多，如中国专利CN200380103341.1公开了分支结构PEG修饰的干扰素a 2a (包括罗氏公司的PEG修饰干扰素a 2a产品“派罗欣”)具有12个修饰位点的异构体。第二种是修饰蛋白质分子N末端氨基酸的自由α-氨基，原理是蛋白质N末端氨基酸的自由α-氨基与蛋白质其它位点中赖氨酸的自由ε-氨基相比具有更低的pKa值，可以在更低的PH下与氨基修饰剂发生修饰反应。但是由于这种pH选择反应的特异性并不是太高，即使在较低的PH下仍可发生赖氨酸的自由ε -氨基上的修饰反应，且修饰过程可能遮蔽蛋白质分子的活性位点，造成修饰产物活性大大降低，因此这种修饰技术在实际应用中也受到限制。第三种是用巯基修饰剂修饰蛋白质分子半胱氨酸上的巯基，由于蛋白质分子中的半胱氨酸数量很少，且多数半胱氨酸上的巯基用于形成分子内或分子间二硫键，只有极少的游离巯基可供修饰 ，所以这种修饰反应的特异性很高。如中国专利申请CN200510076676.X公开了一种巯基PEG修饰剂修饰的干扰素a lb，利用了干扰素a Ib分子中只有一个自由巯基的特点用巯基PEG修饰剂对其进行修饰。但是此种技术实际拓展应用的最大问题是天然蛋白质分子中基本上没有游离的半胱氨酸残基，即使有也会因非常明显的影响蛋白质分子的稳定性和纯化过程(容易形成分子内或分子间二硫键)而使用于修饰的蛋白质纯品不易得到，使修饰过程无法实现(因为一旦形成分子内或分子间二硫键就没有可供修饰的游离半胱氨酸)；且选择天然位点的半胱氨酸进行修饰同样可能遮蔽蛋白质分子的活性位点，造成修饰产物活性大大降低。上述PEG修饰的干扰素a Ib就因干扰素a Ib自身较低的生物活性和修饰后活性残留率也较低，从而使最终的PEG修饰产物活性更低，实际应用效果有待论证。另外干扰素α种类亚型众多，序列中有许多位点可供改变以产生活性更高的突变干扰素α产物，如美国专利US4695623、US4897471、US5372808就公开了一种活性为天然序列干扰素α 10倍以上的复合干扰素分子。所以也可利用干扰素α的这一特点选择活性高、稳定性好与毒性低的突变干扰素α进行PEG修饰，以提高或改善修饰产物的药效、药代与安全性，前述Intermune公司的PEG修饰的复合干扰素就属于此类型,又如中国专利申请CN02159951.3也公开了一种分支结构PEG修饰剂修饰的复合干扰素。但是单一利用此种技术依然不能解决修饰产物组成不均一、纯度差、质量控制不易实现、长效作用不明显且仍有一定毒副作用的问题。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种复合干扰素的半胱氨酸突变体，以解决现有的干扰素α中没有游离的半胱氨酸残基可供特异性位点巯基PEG修饰剂修饰或所具有或突变的游离半胱氨酸残基位点不理想，造成蛋白质分子不稳定、活性低、分离纯化困难而不利于特异性位点PEG修饰剂修饰的问题。为实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术的复合干扰素的半胱氨酸突变体将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第75-77位之一的氨基酸突变为半胱氨酸，分别具有SEQ ID N0.1-3所示的氨基酸序列。本专利技术选择本文档来自技高网...
【技术保护点】
复合干扰素突变体，其特征是将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第75位的氨基酸突变为半胱氨酸，具有SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.复合干扰素突变体，其特征是将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第75位的氨基酸突变为半胱氨酸，具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的复合干扰素突变体的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇衍生物由所述的复合干扰素突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa-40KDa之间。3.根据权利要求2所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂是巯基聚乙二醇修饰剂，选自马来酰亚胺PEG修饰剂、乙烯砜基PEG修饰剂、碘乙酰胺PEG修饰剂或邻吡啶基二硫化物PEG修饰剂中的一种。4.根据权利要求2所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在 10KDa-20KDa 之间。5.根据权利要求2-4之一所述的聚乙二醇衍生物的制备方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：周敏毅，刘金毅，程永庆，
申请(专利权)人：北京三元基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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