核酸的检测方法以及装置、试剂盒制造方法及图纸

本发明专利技术提供不需要特殊的装置、简单并且高精度地对核酸扩增方法扩增出的多链核酸进行检测的方法以及核酸检测装置。本发明专利技术提供利用显色性的无色型染料与多链核酸相接触而产生的显色反应，通过可见光对核酸进行检测的方法，以及使用该方法的核酸检测装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸的检测方法以及装置、试剂盒
本专利技术属于多链核酸的检测方法、以及多链核酸检测装置或试剂盒
技术背景在分子生物学的研究领域、基因检测等的临床应用领域中，对靶核酸进行特异性扩增的方法成为非常重要的技术。作为核酸扩增方法，最通用的是PCR法(PolymeraseChainReaction)，但需要复杂的温度控制；因此，还开发出了LAMP(Loop-MediatedIsothermalAmplification)法、ICAN(lsothermalandChimericprimer-initiatedAmplificationofNucleicacids)法等的等温扩增方法。通过PCR法、LAMP法、ICAN法等扩增出的核酸是双链的，在检测方法中，使用荧光染料的方法的研究盛行。最普通的方法是，是对扩增反应后的溶液实施琼脂糖电泳，使之与EthidiumBromide、SYBRGreen等荧光性嵌入剂(intercalator)结合，而对特异性的荧光进行观察的方法(非专利文件1)。但是，电泳后利用荧光性嵌入剂进行检测的方法，需要30分钟～1小时左右的泳动时间，而且需要对荧光进行检测的UV照射装置、荧光检测器等昂贵的仪器。在没有与其他DNA混合的可能性，只是对扩增产物的有无进行判断时，预先在PCR开始前的反应液中添加荧光性嵌入剂，在扩增反应后进行荧光检测，就可以省略电泳(专利文件1)。但是，存在如下问题：荧光性嵌入剂会与引物等单链核酸结合，因此使背景信号增强，而使得检测灵敏度下降。相对于此，有人开发了：使用与单链核酸结合的荧光性嵌入剂优先发生反应的化合物进行处理而降低背景信号的方法(专利文献2)，以及与单链核酸相比，与双链核酸的反应特异性得到提高的荧光染料(专利文献3)；但是，在进行荧光检测这一点上没有变化。此外，也有人开发了通过采用荧光标记的引物进行核酸扩增反应，并用荧光偏振进行检测的方法(专利文献4)，但通常存在如下问题：荧光引物通常是高价的，或者需要对没能与扩增产物结合的荧光标记引物进行分离操作，因此是较为繁琐的。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开平5-237000号公报专利文献2：国际公开第2002/103053号专利文献3：日本特开2003-240780号公报专利文献4：日本特开平9-187275号公报非专利文献非专利文献1：MolecularCloningSecondEdition，vol.1，6.15(1989)
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的问题在于提供不需要复杂的操作和特殊的装置、简单并且迅速地对核酸扩增反应扩增出的多链核酸进行检测的多链核酸的检测方法，以及多链核酸的检测装置或试剂盒。解决问题的方法本专利技术人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过使多链核酸与显色性的无色型染料接触，使无色型染料的脱离基解离而显色，利用可视光能够检测出核酸。并且，发现利用这样的原理可以制作多链核酸检测装置或试剂盒，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及多链核酸的检测方法，其包括：使显色性的无色型染料与多链核酸接触的工序，该方法中，用可见光对因无色型染料与多链核酸的相互作用而呈现的色调进行检测。优选无色型染料是通式(I)所表示的化合物，(化学式1)(式中，R1、R2以及R3分别独立地表示取代或未取代的芳基。L表示-SO3R4、-NO3、-NO2、-CN、-X、-NHR5、-N(COR6)(COR7)、-SR8、-SSR9、-OR10、-NHSNH2、-OH或-H。其中，R4表示碱金属或氢原子。X表示卤素原子。R5、R6、R7、R8、R9以及R10分别独立地表示烷基、芳基、酰基、烯基或炔基)，由于无色型染料与多链核酸的相互作用，无色型染料的脱离基解离，因脱离基的解离，呈现用可见光能够检测出的色调。优选所述通式(I)所表示的化合物是通式(II)所表示的化合物，(化学式2)(式中，L与上述相同。R11以及R12分别独立地表示取代或未取代的芳基。R13、R14、R15、R16以及R17分别独立地表示卤素原子、羧基、磺基、硝基、氰基、酰胺基、氨基、烷基、芳基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷氨基、芳氨基、酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、烷磺酰基或芳磺酰基)。优选无色型染料为三芳基甲烷类染料与亲核剂的反应产物。优选三芳基甲烷类染料是选自龙胆紫、结晶紫、甲基绿、孔雀绿、维多利亚蓝、副品红以及它们的衍生物中的1种以上的染料。优选亲核剂为选自亚硫酸根离子、亚硫酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、氰离子、卤化物离子、氮亲核剂、硫亲核剂、碱金属烷氧化物、碱金属氢氧化物、以及氢化物亲核剂中的1种以上的亲核剂。此外，本专利技术还涉及多链核酸检测装置或试剂盒，其含有：(d)保持无色型染料的载体，(e)供被检测物通过载体(d)的通路，以及(f)用可见光检测因被检测物与无色型染料相互作用而呈现的色调，从而对多链核酸的存在进行判定的部位。优选无色型染料是通式(I)所表示的化合物，(化学式3)(式中，R1、R2以及R3分别独立地表示取代或未取代的芳基。L表示-SO3R4、-NO3、-NO2、-CN、-X、-NHR5、-N(COR6)(COR7)、-SR8、-SSR9、-OR10、-NHSNH2、-OH或-H。其中，R4表示碱金属或氢原子。X表示卤素原子。R5、R6、R7、R8、R9以及R10分别独立地表示烷基、芳基、酰基、烯基或炔基)，由于无色型染料与多链核酸的相互作用，无色型染料的脱离基解离，因脱离基的解离，呈现用可见光能够检测出的色调。优选载体(d)保持三芳基甲烷类染料和亲核剂的混合液。优选三芳基甲烷类染料是选自龙胆紫、结晶紫、甲基绿、孔雀绿、维多利亚蓝、副品红以及它们的衍生物中的1种以上的染料。优选亲核剂为选自亚硫酸根离子、亚硫酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、氰离子、卤化物离子、氮亲核剂、硫亲核剂、碱金属烷氧化物、碱金属氢氧化物、以及氢化物亲核剂中的1种以上的亲核剂。专利技术的效果通过本专利技术的方法，可以不使用特别的检测仪器，通过多链核酸和无色型染料的接触产生的显色反应，对核酸合成或扩增的有无进行目测检测。此外，本专利技术所涉及的核酸检测装置，只需将含有多链核酸的被检测物添加在装置上，就可以通过显色反应而迅速目测检测出被检测物。附图说明[图1]示出本专利技术的核酸检测用色谱型装置的一个例子的概略图。[图2]示出本专利技术的核酸检测用的过滤器型装置的一个例子的概略图。[图3]示出本专利技术的核酸检测用吸引型装置的一个例子的概略图。[图4]示出本专利技术的核酸检测用流路型装置的一个例子的概略图。[图5]示出本专利技术的核酸检测用管型装置的一个例子的概略图。符号说明1.保持有通过与多链核酸接触而显色的无色型染料的载体2.样品添加部位(玻璃纤维滤纸)3.判定部位(滤纸)4.基体材料5.保持载体的支撑体6.被检测物收纳容器7.吸量管尖头8.具有通路的芯片9.试剂添加部位10.通路11.染料12.针状结构13.管14.判定部位具体实施方式以下详细地记载本专利技术。1.核酸的检测方法本专利技术涉及多链核酸的检测方法，其包括使显色性的无色型染料与多链核酸接触的工序，该方法中，用可见光对因无色型染料与多链核酸的相互作用而呈现的色调进行检测。检测对象的多本文档来自技高网...

【技术保护点】
多链核酸的检测方法，其包括：使显色性的无色型染料与多链核酸接触的工序，该方法中，用可见光对因无色型染料与多链核酸的相互作用而呈现的色调进行检测。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.22 JP 2010-2118891.多链核酸的检测方法，其包括：使无色型染料与多链核酸接触的工序，所述无色型染料为处于显色状态的染料与亲核剂的反应产物，该方法中，用可见光对因无色型染料与多链核酸的相互作用而呈现的色调进行检测，其中，无色型染料是通式(I)所表示的化合物，式(I)中，R1、R2以及R3分别独立地表示取代或未取代的芳基，L表示-SO3R4、-NO3、-NO2、-CN、-X、-NHR5、-N(COR6)(COR7)、-SR8、-SSR9、-OR10、-NHSNH2、-OH或-H，其中，R4表示碱金属或氢原子，X表示卤素原子，R5、R6、R7、R8、R9以及R10分别独立地表示烷基、芳基、酰基、烯基或炔基；由于无色型染料与多链核酸的相互作用，无色型染料的通式(I)中L所表示的脱离基解离，因该脱离基的解离，呈现用可见光能够检测出的色调。2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述通式(I)所表示的化合物是通式(II)所表示的化合物，式(II)中，L表示-SO3R4、-NO3、-NO2、-CN、-X、-NHR5、-N(COR6)(COR7)、-SR8、-SSR9、-OR10、-NHSNH2、-OH或-H，其中，R4表示碱金属或氢原子，X表示卤素原子，R5、R6、R7、R8、R9以及R10分别独立地表示烷基、芳基、酰基、烯基或炔基，R11以及R12分别独立地表示取代或未取代的芳基，R13、R14、R15、R16以及R17分别独立地表示卤素原子、羧基、磺基、硝基、氰基、酰胺基、氨基、烷基、芳基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷氨基、芳氨基、酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、烷磺酰基或芳磺酰基。3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，无色型染料为三芳基甲烷类染料与亲核剂的反应产物。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫本重彦，直原启明，佐野创太郎，高桥孝治，友野润，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：日本;JP