用于制备重组人生长激素的改良方法技术

本发明专利技术提供了用于制备人生长激素的改良方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及重组人生长激素(hGH)制备的领域。
技术介绍
人生长激素(hGH)，也称为促生长激素(somatropin) (INN)或促生长素(somatotropin),是由垂体前叶的促生长素细胞制造和分泌的蛋白质激素。通过其对蛋白质、碳水化合物和脂质的代谢的影响，人生长激素在儿童时期的身体生长和成年时期的代谢中起到关键作用。人生长激素是191个氨基酸的单个多肽链，其具有两个二硫键，一个位于Cys-53和Cys-165之间，在分子中形成大的环，而另一个位于Cys_182和Cys_189之间，在C-末端附近形成小的环。重组DNA技术已经允许在大量不同系统中生产无限的hGH供应。一个这样的系统是细菌，例如大肠杆菌(E.coli)。尽管这种方法已经建立得很好并已被广泛使用，但如一直以来的任何技术方法一样，还可以对其进行改进。当重组hGH在大肠杆菌中被表达为包含体时，该包含体通常在还原剂和/或离液剂的存在下溶解，由此完全使hGH复性并促使hGH合适的折叠成为其生物活性形式且减少团聚体的形成。专利技术概述现在，本专利技术提供了，在hGH生产期间，在无需使用还原剂和/或离液剂的情况下，显著减少团聚体形成。在这点上，本发 明提供了一种用于制备人生长激素的方法，其包括:(i)发酵生产人生长激素(hGH)的大肠杆菌细胞；(ii)从所述大肠杆菌细胞回收包含体，并将所述回收的包含体在碱性pH溶解以提供溶解的hGH ；(iii)任选地冻干溶解的hGH ；其特征在于，所述发酵在包含锰、锌、钴、钥、钙、铜和硼作为痕量元素的培养基中进行。本专利技术还提供一种用于减少在制备人生长激素的过程中形成的人生长激素聚合形式的量的方法，其包括:(i)发酵生产人生长激素(hGH)的大肠杆菌细胞；(ii)从所述大肠杆菌细胞回收包含体，并将所述回收的包含体在碱性pH溶解以提供溶解的hGH ；(iii)任选地冻干溶解的hGH ;其特征在于，所述发酵在包含锰、锌、钴、钥、钙、铜和硼作为痕量元素的培养基中进行。专利技术详述本专利技术的制备人生长激素的方法包括以下步骤:(i)发酵生产人生长激素(hGH)的大肠杆菌细胞；( )从所述大肠杆菌细胞回收包含体，并将所述回收的包含体在碱性pH溶解以提供溶解的hGH ；(iii)任选地冻干溶解的hGH ；其特征在于，所述发酵在包含锰、锌、钴、钥、钙、铜和硼作为痕量元素的培养基中进行。本专利技术的减少在制备人生长激素的过程中形成的人生长激素聚合形式的量的方法包括以下步骤:(i)发酵生产人生长激素(hGH)的大肠杆菌细胞；(ii)从所述大肠杆菌细胞回收包含体，并将所述回收的包含体在碱性pH溶解以提供溶解的hGH ；(iii)任选地冻干溶解的hGH ；其特征在于，所述发酵在包含锰、锌、钴、钥、钙、铜和硼作为痕量元素的培养基中进行。如本文中可交换使用的，“人生长激素”和“hGH”应当被理解为包括具有191个氨基酸的重组人生长激素或者具有192个氨基酸的Met-hGH ( S卩，在N末端有一个额外的甲硫氨酸的hGH)。如本文所使用的，“hGH聚合形式”应被理解为包括不是具有191个氨基酸的hGH或具有192个氨基酸的hGH(在N末端有一个额外的甲硫氨酸的hGH)的任何形式的hGH，如，但不限于hGH的 二聚物和低聚物。如本文所使用的，“培养基”应当被理解为包括发酵罐培养基和/或生产培养基。可以通过常规手段提供在培养基中的痕量元素，例如通过使用市售的痕量元素的盐，包括它们的酸和碱，以及水合物。可以以固体盐的形式或者含有一种以上所述盐的水溶液的形式，将它们引入培养基中。在一个实施方案中，它们以痕量元素溶液的形式被添加，所述痕量元素溶液包含预定浓度的每种痕量元素。痕量元素溶液还可以含有酸或碱以调节pH,并且例如,将痕量元素保持在溶液中。可以使用例如一水合硫酸锰(MnSO4.H2O)提供作为痕量元素的锰。可以通过使用例如七水合硫酸锌(Ζη504.7H20)提供作为痕量元素的锌。可以通过使用例如六水合氯化钴(CoCl2.6H20)提供作为痕量元素的钴。可以使用例如二水合钥酸钠(NaMoO4.2H20)提供作为痕量元素的钥。可以使用例如二水合氯化钙(CaCl2.2H20)提供作为痕量元素的钙。可以使用例如五水合硫酸铜(Co504 *5H20)提供作为痕量元素的铜。可以使用例如硼酸(H3BO3)提供作为痕量元素的硼。也可以提供铁作为痕量元素。痕量元素以以下浓度范围(基于培养基的总体积)范围”)存在于培养基中，并且在一个实施方案中，以所指示的具体浓度(“实施方案”)存在:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备人生长激素(hGH)的方法，所述方法包括：(i)发酵生产人生长激素(hGH)的大肠杆菌(E.coli)细胞；(ii)从所述大肠杆菌细胞回收包含体，并将所述回收的包含体在碱性pH溶解以提供溶解的hGH；(iii)任选地冻干溶解的hGH；其特征在于，所述发酵在包含锰、锌、钴、钼、钙、铜和硼作为痕量元素的培养基中进行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.21 EP 10177997.31.一种用于制备人生长激素(hGH)的方法，所述方法包括: (i)发酵生产人生长激素(hGH)的大肠杆菌(E.coli)细胞； ( )从所述大肠杆菌细胞回收包含体，并将所述回收的包含体在碱性PH溶解以提供溶解的hGH ； (iii)任选地冻干溶解的hGH ； 其特征在于，所述发酵在包含锰、锌、钴、钥、钙、铜和硼作为痕量元素的培养基中进行。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含基于所述培养基的总体积的以下浓度的痕量元素:锰 4.9 μΜ锌 8.0 μΜ钴 7.0 μΜ钔 6.9 μΜ钙 16.9 μΜ铜 6.1 μΜ硼 6.7 μΜ。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述痕量元素以痕量元素溶液的形式添加至所述培养基中。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述痕量元素溶液包含lg/L—水合硫酸锰，和/或其中所述痕量元素溶液包含约2.8g/L七水合硫酸锌,和/或其中所述痕量元素溶液包含2g/L六水合氯化钴,和/或其中所述痕量元素溶液包含2g/L 二水合钥酸钠,和/或其中所述痕量元素溶液包含3g/L 二水合氯化钙，和/或其中所述痕量元素溶液包含1.85g/L五水合硫酸铜，和/或其中所述痕量元素溶液包含0.5g/L硼酸。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述痕量元素溶液包含lg/L—水合硫酸锰、2.78g/L七水合硫酸锌、2g/L六水合氯化钴、2g/L 二水合钥酸钠、3g/L 二水合氯化钙、1.85g/L五水合硫酸铜和0.5g/L硼酸。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述碱性PH为约10至约12.5。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述碱性pH为约12。8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i...

【专利技术属性】
技术研发人员：多夫·坎纳，埃利·施梅尔，
申请(专利权)人：辉凌公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL