一种HIP-55的新用途制造技术

本发明专利技术公开了一种HIP-55的新用途。本发明专利技术提供的HIP-55蛋白、HIP-55蛋白编码基因或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体或含有HIP-55蛋白编码基因的腺病毒在制备具有如下1）或2）功能的产品中的应用：1）抑制心脏成纤维细胞增殖；2）抑制P38MAPK激酶活性；所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术发现HIP-55在大鼠不同器官中都有表达，尤其心脏中有高水平的表达，进一步异丙肾上腺素（ISO）诱导，在乳大鼠心肌成纤维细胞中过表达HIP-55明显抑制心脏成纤维细胞增殖；在过表达HIP-55心脏成纤维细胞中能够抑制ISO诱导的P38MAPK的激活以及激酶活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种HIP-55的新用途。
技术介绍
HIP-55 (hematopoietic progenitor kinase I[HPK1]-1nteracting proteinof55kDa ;也称为drebrin-like protein、mAbpl或SH3P7)是一个包含多功能域的蛋白质。其结构主要包含着N端的F-actin蛋白结合结构域和C端SH3结构域。HIP-55参与突触发生、受体内吞、骨架重排及信号转导。目前对HIP-55功能了解较少尚无对HIP-55在心血管系统方面的研究报道。心血管疾病是中国居民健康的“头号杀手”，每年主要用于心血管病的直接医疗费用已达1300亿元人民币。心肌纤维化是心脏重塑的重要病理改变，是指在心肌的正常组织结构中心肌成纤维细胞过度分裂，胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变，引起心肌僵硬度增加、舒缩功能受限，严重影响心脏的功能。这种病理变化在多种心血管疾病中存在，与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关。心肌纤维化是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键，其严重程度和疾病的发生发展及预后密切相关。因此，预防和逆转心肌纤维化具有重要的意义。大量研究表明儿茶酚胺-肾上腺素系统过度激活是促心肌纤维化的重要因素，儿茶酚胺(如异丙肾上腺素isoproteixmol，Iso)通过3 -ARs促进心肌成纤维细胞增殖和胶原合成增加，从而导致心肌纤维化、心脏功能的恶化和心衰的形成。同时P-ARs阻滞剂能够显著改善患者的预后。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供HIP-55蛋白、HIP-55蛋白编码基因或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体或含有HIP -55蛋白编码基因的腺病毒的新用途。本专利技术提供的HIP-55蛋白、HIP-55蛋白编码基因或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体或含有HIP-55蛋白编码基因的腺病毒在制备具有如下I)或2)功能的产品中的应用:I)抑制心脏成纤维细胞增殖；2 )抑制P38MAPK激酶活性；所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述抑制心脏成纤维细胞增殖和所述抑制P38MAPK激酶活性均在(异丙肾上腺素)ISO诱导下进行。上述抑制心脏成纤维细胞增殖是在ISO诱导下进行；所述抑制心脏成纤维细胞增殖具体通过如下I)或2)体现:I)在ISO诱导下减少心脏成纤维细胞Brdu参入量；2)在ISO诱导下减少心脏成纤维细胞CCK8吸光值。上述抑制P38MAPK激酶活性是在ISO诱导下进行；抑制P38MAPK激酶活性通过降低P38MAPK激酶底物ATF-2的磷酸化水平体现。上述应用中，所述HIP-55蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I。上述应用中，所述含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体为重组腺病毒载体；在本专利技术的实施例中，上述重组腺病毒载体为将HIP-55蛋白编码基因与Flag-1RES/DesRedE2 融合成为 HIP-55_Flag-1RES/DesRedE2 基因后插入 pAd/CMV/V5_DEST中，得到的重组腺病毒载体pAd-HIP-55-Flag-1RES/DesRedE2。所述含有HIP-55蛋白编码基因的腺病毒为将所述含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体转染细胞，包装得到的腺病毒。上述应用中，所述产品为药物。上述应用中，所述心脏成纤维细胞为离体心脏成纤维细胞。上述应用中，所述抑制心脏成纤维细胞增殖是通过抑制P38MAPK激酶活性实现。本专利技术的实验证明，本专利技术发现经异丙肾上腺素(ISO)诱导，在乳大鼠心肌成纤维细胞中过表达HIP-55明显抑制心脏成纤维细胞增殖，与之相反，应用RNAi方法knock downHIP-55明显促进心脏成纤维细胞增殖；在过表达HIP-55心脏成纤维细胞中能够抑制ISO诱导的P38MAPK的激活以及激酶活性，而在Knock-down HIP-55心肌成纤维细胞中能够增强ISO诱导的P38MAPK的激活以及激酶活性；发现HIP-55是一种新的对心脏纤维化具有保护作用的蛋白质，为临床诊断、治疗及新药开发提供了新的靶点。附图说明`图1为过表达HIP-55蛋白质表达水平的检测A为携带Dserd-HIP-55基因腺病毒及携带Dserd基因的对照腺病毒转染效率的检测；B为过表达HIP-55蛋白质表达水平的检测图2为HIP_55shRNA敲减HIP-55蛋白质表达水平的检测图3为HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖(Brdu法)A为过表达HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖；B为敲减HIP-55促进心肌成纤维细胞增殖图4为HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖(CCK8法)A为过表达HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖；B为敲减HIP-55促进心肌成纤维细胞增殖图5为ISO通过p38MAPK诱导的心脏成纤维细胞增殖图6为HIP-55抑制心脏成纤维细胞P38MAPK激酶活性A和B为过表达HIP-55抑制心肌成纤维细胞P38MAPK激酶活性；C和D为敲减HIP-55增强心肌成纤维细胞P38MAPK激酶活性。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中定量试验均重复三次，结果取平均值。鼠HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，编码该蛋白的基因的核苷酸序列为序列表中的序列I。下述实施例采用的离体乳大鼠心脏成纤维细胞通过如下方法获得:实验用SD乳大鼠购自北京大学医学部实验动物部，完全遵照北京大学医学部实验动物相关伦理学标准；采用酶消化和差速贴壁方法进行分离培养；细胞在含有10%胎牛血清(Biochrom AG, Berlin, Germany)的高糖 DMEM (Hyclone, Logan, UT)培养基里,其中添加IOOii g/ml链霉素及100U/ml青霉素，置于37°C的5%C02孵箱里培养，具体如下:出生1-3天内的SD乳大鼠，浸没于75%酒精；眼科剪开胸取心脏；置于冰冷的Hank’s缓冲液中剪除心房部分并洗涤两次。转移到IOml血清瓶中，剪碎组织后Hank’s缓冲液再洗涤两次。弃去上清；加入4mL0.1%胰蛋白酶置于37°C水浴中平缓搅动消化，每次4min,弃去前两次细胞悬液。继续进行6-8次消化，收集细胞悬液，加入含4mLDMEM完全培养基(含10%胎牛血清)的离心管中，IOOOrpmX 5min离心，取4mL DMEM完全培养基洗涤细胞沉淀，再次重悬离心。最后合并收集细胞，接种于IOcm培养皿，37°C、5% CO2培养箱静置培养2小时。吸取未贴壁的心肌细胞悬液，已贴壁的成纤维细胞用DMEM洗涤后，加入DMEM完全培养基进行培养。长满后传代，实验选用第二代离体心脏成纤维细胞。下面实施例采用的抗体如下:Anti_EIF5 (Santa cruz公司；货号:c_282)、Ant1-P38MAPK (santa cruz 公司；货号:sc-7194)、Ant1-phospho_P38MAPK (cellsignaling ;货号:#9211s)。实施例1、HIP-55shRNA、过表达HIP-55的重组腺病毒和RNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
HIP‑55蛋白、HIP‑55蛋白编码基因或含有HIP‑55蛋白编码基因的重组载体或含有HIP‑55蛋白编码基因的腺病毒在制备具有如下1）或2）功能的产品中的应用：1）抑制心脏成纤维细胞增殖；2）抑制P38MAPK激酶活性；所述HIP‑55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

【技术特征摘要】
1.HIP-55蛋白、HIP-55蛋白编码基因或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体或含有HIP-55蛋白编码基因的腺病毒在制备具有如下I)或2)功能的产品中的应用: 1)抑制心脏成纤维细胞增殖； 2)抑制P38MAPK激酶活性； 所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于: 所述抑制心脏成纤维细胞增殖和所述抑制P38MAPK激酶活性均在ISO诱导下进行。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于: 所述HIP-55蛋白编码基因的核苷酸序列为序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：李子健，张幼怡，邢瑞，杨承志，吕志珍，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，
类型：发明
国别省市：北京;11