针对人抗苗勒管激素II型受体的新的突变型人源化12G4抗体及其片段制造技术

本发明专利技术涉及针对抗苗勒管激素II型受体的新的突变型人源化12G4抗体及其片段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对人抗苗勒管激素I I型受体的新的突变型人源化12G4抗体及其片段本专利技术涉及针对抗苗勒管激素II型受体的新的突变型人源化12G4抗体及其片段。卵巢癌是妇科癌症的主要原因并且是女性中癌症死亡率的第五大原因，其三个组织学来源为下列:■表面上皮(具有不同亚型的上皮性肿瘤)，其占卵巢癌的85-90%，■生殖索/间质(粒层细胞瘤(全部卵巢癌的3%))，其占卵巢肿瘤的大约10%，■生殖细胞，其占卵巢癌的5%。卵巢癌在初始阶段期间通常是无症状的，这使它得到“无声杀手”的别名(La Marca A.,Volpe A.The Ant1-Mullerian hormone andovarian cancer.HumanReproduction Update,第 13 卷，第 3 期，第 265-273 页,2007)。存在有四个阶段和预后(FIG0分类:国际妇产科学联盟)，对于其来说，存活率自第二阶段开始大大地降低:阶段1:局限于卵巢的肿瘤(5年存活率:90_70%)，阶段I1:延伸至骨盆的在一个或两个卵巢中的肿瘤(5年存活率:70_40%)，阶段II1:延伸至骨盆外的在一个或两个卵巢中的肿瘤(5年存活率:20%)， 阶段IV:远程转移，不包括腹膜转移(5年存活率:〈10%)，(Fauci, Braunwald等人，Principles of internal medicine.Harrison’s第 17版/National Cancer Institutecancer, gov/CNGOF (法国国家妇产科学学会))。对于治疗卵巢癌所采用的主要策略是外科手术和化学疗法，特别是作为第一线治疗,例如卡钼和紫杉醇的混合物。最近还开发了单克隆抗体，例如西妥昔单抗，其针对表皮生长因子受体(EGFR, Ozols R.F 等人，Focus on epithelial ovarian cancer,CancerCell.2004，Jan;5(l):19-24)0其他单克隆抗体目前处于III期临床阶段，例如针对CA-125的阿巴伏单抗(abagovomab)、针对血管内皮生长因子(VEGF-A)的阿瓦斯丁或针对叶酸受体a (FRA)的法利珠单抗(far Ietuzumab )。人抗苗勒管激素是具有560个氨基酸的糖蛋白，其为TGF-P家族的成员。这是由胎儿睾丸的塞尔托利细胞所释放的激素，其引起苗勒管的退化。在成人中，它在塞尔托利细胞和莱迪希细胞(睾丸)以及粒层细胞(卵巢)中表达。它在成人卵巢的调节卵泡生成的活性中发挥作用。抗苗勒管激素II型受体(AMHR-1I)是具有573个氨基酸的肽，并且具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性。它牵涉与人的生殖系统的发育相关的苗勒管的退行。苗勒管在男性中萎缩，在男性中它仅形成前列腺囊和睾丸附件；但苗勒管在女性中持续存在，在女性中它作为输卵管、子宫和大部分阴道的起源。该受体经常在人卵巢的肿瘤上皮细胞上表达。国际申请W02008/053330描述了用于治疗卵巢癌的针对AMHR-1I的鼠类12G4单克隆抗体。然而，本领域技术人员众所周知的是，给人施用鼠类单克隆抗体引起免疫反应。该国际申请还提到所述抗体可以是嵌合的或人源化的，但并没有照那样的来描述它们。然而，嵌合抗体也引发免疫反应，并且弱免疫原性的人源化抗体具有这样的缺点，即具有可能降低的对于抗原的结合亲和力并因而是活性较低的。根据该申请，可能的是，通过存在于人源化抗体中的氨基酸的突变来增加所述亲和力，这通过尤其是修饰人源化抗体的肽序列但同时不妨碍亲水指数，即其疏水性和其电荷，例如通过下列氨基酸的置换:精氨酸-赖氨酸置换或谷氨酸-天冬氨酸置换或丝氨酸-苏氨酸置换或谷氨酰胺-天冬酰胺置换或缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸置换。本专利技术的目标之一是提供突变型人源化12G4抗体，或所述抗体的片段，其具有至少与相应的非突变型嵌合抗体相等的亲和力和对于受体AMHR-1I的特异性，并且不引发免疫反应。本专利技术的另一个目标还在于提供产生特异于受体AMHR-1I的所述抗体的方法。本专利技术的另一个目标涉及这些抗体作为用于治疗卵巢癌的药物的用途。本专利技术涉及人源化12G4单克隆抗体，其包含下列组分或由下列组分构成:a)轻链，其包含下列组分或由下列组分构成:-可变区，其氨基酸序列由SEQID NO: 2 (无前导序列)或SEQ ID NO:4 (具有前导序列)表示，和-恒定区，其氨基酸序列由SEQID NO: 6或由与SEQ ID NO: 6具有至少80%的同源性的序列表示，b)重链，其包含下列组分或由下列组分构成:-可变区，其氨基酸序列由SEQID N0:8 (无前导序列)或SEQ ID NO: 10 (具有前导序列)表示，和-恒定区，其氨基酸序列由SEQID NO: 12或由与SEQ ID NO: 12具有至少80%的同源性的序列表示，所述人源化12G4单克隆抗体是突变的，在轻链和/或重链中包含至少一个突变，并且具有至少与嵌合12G4单克隆抗体相等的对于人抗苗勒管激素II型受体(AMHRII)的KD，所述嵌合12G4单克隆抗体包含下列组分或由下列组分构成:a)轻链，其由下列组分构成:-可变区，其氨基酸序列由SEQID NO: 14 (无前导序列)表示，和-恒定区,其氨基酸序列由SEQID N0:6表示，b)重链，其由下列组分构成:-可变区，其氨基酸序列由SEQID NO: 18 (无前导序列)或SEQ ID NO: 10 (具有前导序列)表示，和-恒定区，其氨基酸序列由SEQID NO: 12表示，对于所述受体，Kd优选地小于101，尤其是小于1(T8M，特别地为KT9M至l(TnM。本专利技术的抗体还具有至少与鼠类12G4抗体的亲和力的三分之一或一半相等的亲和力。在整个说明书中，在序列编号后面的处于括号之中的表述“具有前导序列”意味着所述序列包含信号肽或编码信号肽的序列，信号肽即为决定蛋白质将被分泌的肽。相反地，括号之中的表述“无前导序列”意味着所述序列不包含信号肽或编码信号肽的序列。本专利技术基于专利技术人所作出的这样的发现，即本专利技术的突变型人源化12G4抗体，尽管在CDR(三个决定抗原识别的区域)(其亲水指数并非不受妨碍)中，即在对于与抗原的亲和力和结合来说关键的并且通常仅支持具有相同亲水指数的氨基酸的置换(例如精氨酸-赖氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、丝氨酸-苏氨酸、谷氨酰胺-天冬酰胺或缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸)的区域中具有至少一个突变，但依然具有下列特性:-它具有至少与相应的嵌合12G4抗体相似或甚至比相应的嵌合12G4抗体小的对于受体AMHR-1I的Kd (根据实施例1所测定的)，并因此具有比相应的嵌合12G4抗体大或与相应的嵌合12G4抗体相等的亲和力，或者相比于现有技术的抗体或抗体片段而言，-它具有对于受体AMHR-1I的特异性，-它不引发免疫反应或者引发比鼠类抗体更小的反应。作为例子，实施例1呈现了用在CHO或YB2/0细胞中产生的本专利技术的抗体所获得的Kd。在整个说明书中，术语“12G4”和也使用的术语“LFB112”，是指相同的事物并且表示相同的抗体。所述抗体的亲和力可以通过本领域技术人员熟知的BIAcore测试来测定。在本专利技术中，术语“抗体”是指免疫球蛋白，即参与获得性免疫应答的本文档来自技高网...

【技术保护点】
人源化12G4单克隆抗体，其包含下列组分或由下列组分构成：a)轻链，其包含下列组分或由下列组分构成：‑可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4表示，和‑恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:6或由与SEQ ID NO:6具有至少80%的同源性的序列表示，b)重链，其包含下列组分或由下列组分构成：‑可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10表示，和‑恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:12或由与SEQ ID NO:12具有至少80%的同源性的序列表示，所述人源化12G4单克隆抗体是突变的，在轻链和/或重链中包含至少一个突变，并且具有至少与嵌合12G4单克隆抗体相等的对于人抗苗勒管激素II型受体（AMHRI I）的KD，所述嵌合12G4单克隆抗体包含下列组分或由下列组分构成：a)轻链，其由下列组分构成：‑可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:14表示，和‑恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:6表示，b)重链，其由下列组分构成：‑可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:10表示，和‑恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:12表示，对于所述受体，KD优选地小于10‑7M，尤其是小于10‑8M，特别地为10‑9M至10‑11M。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.12 FR 10537121.人源化12G4单克隆抗体，其包含下列组分或由下列组分构成: a)轻链，其包含下列组分或由下列组分构成: -可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4表示，和 -恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID N0:6或由与SEQ ID N0:6具有至少80%的同源性的序列表示， b)重链，其包含下列组分或由下列组分构成: -可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO: 10表示，和 -恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 12或由与SEQ ID NO: 12具有至少80%的同源性的序列表不， 所述人源化12G4单克隆抗体是突变的，在轻链和/或重链中包含至少一个突变，并且具有至少与嵌合12G4单克隆抗体相等的对于人抗苗勒管激素II型受体(AMHRI I)的KD，所述嵌合12G4单克隆抗体包含下列组分或由下列组分构成: a)轻链，其由下列组分构成: -可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 14表示，和 -恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:6表示， b)重链，其由下列组分构成: -可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 10表示，和 -恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 12表示， 对于所述受体，Kd优选地小于10_7M，尤其是小于10_8M，特别地为KT9M至I(T11M。2.根据权利要求1的突变型人源化12G4单克隆抗体，其在轻链可变区的至少一个CDR中包含至少一个突变，并且具有至少与所述嵌合12G4单克隆抗体相等的对于所述受体的亲和力。3.根据权利要求1至2之一的突变型人源化12G4单克隆抗体，其中所述在轻链可变区的至少一个CDR中的突变之中的至少一个突变位于包括在轻链可变区的包含氨基酸179至氨基酸184的区域中的⑶R中，所述轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:2表示。4.根据权利要求1至3之一的突变型人源化12G4单克隆抗体，其中所述位于包括在包含氨基酸179至氨基酸184的区域中的CDR中的突变之中的至少一个突变相应于至少一个下列氨基酸的置换:S179P、E184K、E184G、E184D、S182F。5.根据权利要求1至4之一的突变型人源化12G4单克隆抗体，其还在轻链(VL)的FR区中包含至少一个突变。6.根据权利要求1至5之一的突变型人源化12G4单克隆抗体，其还在重链中包含至少一个突变。7.根据权利要求1至6之一的突变型人源化12G4单克隆抗体，其中所述在轻链(VL)的FR区中的突变之中的至少一个突变位于与包含氨基酸179至氨基酸184的区域相邻的FR区中。8.根据权利要求1至6之一的突变型人源化12G4单克隆抗体，其中所述在轻链(VL)的FR区中的突变之中的至少一个突变相应于至少一个下列氨基酸的置换:I132T、A143T、T150A、S158P、L175Q、Y178H、V187A、S19 2T、G197D、F212S。9.根据权利要求1至8之一的突变型人源化12G4单克隆抗体，其中所述在重链中的突变之中的至少一个突变相应于至少一个下列氨基酸的置换:Q1E、Q3E、Q3R、Q6E、A9T、Vl 1A、K12R、K13R、K19E、V20A、A24G、A24V、A24T、Q39E、A40V、S31G、L45P、D56N、A76T、A79T、R87G、T58A、Q62R、V67M、I70N、T74A、S77P、A79T、S88P、E89D、F102S、A103T、LllOP、SlHT010.根据权利要求1至9之一的突变型人源化12G4单克隆抗体，其具有选自下列的轻链和重链: a)轻链，其包含可变区和恒定区或由可变区和恒定区构成，所述可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:2表示，在该SEQ ID NO:2中进行了至少一个下列位于⑶R之一中的氨基酸置换:S179P、E184K、E184G、E184D、S182F ;并且所述恒定区的氨基酸序列由SEQ ID NO:6表示；或 轻链，其包含可变区和恒定区或由可变区和恒定区构成，所述可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:2表示，在该SEQ ID NO:2中进行了至少一个下列位于⑶R之一中的氨基酸置换:5179 41841(4184641840、5182 ，和进行了至少一个下列位于？1 区中的氨基酸置换:I132T、A143T、T150A、S158P、L175Q、Y178H、V187A、S192T、G197D、F212S ;并且所述恒定区的氨基酸序列由SEQ ID NO:6表不， b)重链，其氨基酸序列由SEQ ID NO:58表示，在该SEQ ID NO:58中进行了至少一个下列氨基酸的置换:Q1E、Q3E、Q3R、Q6E、A9T、Vl 1A、K12R、K13R、K19E、V20A、A24G、A24V、A24T、Q39E、A40V、S31G、L45P、D56N、A76T、A79T、R87G、T58A、Q62R、V67M、I70N、T74A、S77P、A79T、S88P、E89D、F102S、A103T、LllOP、S114T。11.根据权利要求1至10之一的突变型人源化12G4单克隆抗体，其具有选自下列的轻链和重链: a)轻链，其包含可变区和恒定区或由可变区和恒定区构成，所述可变区的氨基酸序列由下列表示:-SEQ ID NO:22 或 SEQ ID NO:24，或-SEQ ID NO:30 或 SEQ ID NO:32，或-SEQ ID NO:34 或 SEQ ID NO:36，或-SEQ ID NO:46 或 SEQ ID NO:48， 并且所述恒定区的氨基酸序列由SEQ ID NO:6表示， b)重链，其包含可变区和恒定区或由可变区和恒定区构成，所述可变区的氨基酸序列由下列表示:-SEQ ID NO:38 或 SEQ ID NO:40，-SEQ ID NO:26 或 SEQ ID NO:28，-SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:10，-SEQ ID NO:42 或 SEQ ID NO:44,-SEQ ID NO:50 或 SEQ ID NO:52， 并且所述恒定区的氨基酸序列由SEQ ID NO: 12表示。12.根据权利要求10的突变型人源化12G4单克隆抗体，其具有: a)轻链，其由下列所表示的氨基酸序列构成:-SEQ ID NO:70 或 SEQ ID NO:72，和 b)重链，其由下列所表示的氨基酸序列构成:-SEQ ID NO:74 或 SEQ ID NO:76， 或者 a)轻链，其由下列所表示的氨基酸序列构成:-SEQ ID NO:78 或 SEQ ID NO:80，和 b)重链，其由下列所表示的氨基酸序列构成: -SEQ ID NO:58 或 SEQ ID NO:60， 或者 a)轻链，其由下列所表示的氨基酸序列构成:-SEQ ID NO:82 或 SEQ ID NO:84，和 b)重链，其由下列所表示的氨基酸序列构成:-SEQ ID NO:86 或 SEQ ID NO:88， 或者 a)轻链，其由下列所表示的氨基酸序列构成:-SEQ ID NO:78 或 SEQ ID NO:80，和 b)重链，其由下列所表示的氨基酸序列构成:-SEQ ID NO:90 或 SEQ ID NO:92， 或者 a)轻链，其由下列所表示的氨基酸序列构成:-SEQ ID NO:94 或 SEQ ID NO:96，和 b)重链，其由下列所表示的氨基酸序列构成:-SEQ ID NO:98 或 SEQ ID NO:100。13.根据权利要求1至12之一...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·拜赫伦斯，I·纳瓦罗特隆，
申请(专利权)人：LFB生物技术公司， 蒙彼利埃第一大学， 国家抗癌中心， 国家健康与医学研究院，
类型：发明
国别省市：法国;FR