用于从包括成分血的含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法技术

一种用于从含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法，包括：(a)通过至少部分地使包含在样品中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白，将所述目标分子或颗粒捕获在纤维蛋白网(fibrin network)中；(b)回缩所述纤维蛋白网，以形成纤维蛋白凝块；(c)从周围的样品介质中分离所述纤维蛋白凝块。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于样品处理的用于从所述样品中分离目标分子或颗粒的方法。更具体地，本专利技术涉及在其检测和分析之前，允许从包含纤维蛋白原蛋白的样品中有效分离且浓缩目标分子或颗粒的样品制备程序。相关技术的描述在生物测定中，从各种样品中提取、浓缩及纯化目标分子、颗粒或分析物(即，样品制备)的能力代表关键步骤且作为用于有效的目标检测和分析的首要步骤是具有挑战性的。在生物测定中，在检测限、再现性及所述颗粒或分析物受到其它化合物的干扰的方面，样品制备步骤是主要的限速步骤。现有的样品制备程序通常涉及冗长的手工或复杂的机器人移液步骤，包括长时间的离心循环。这样的程序不仅是缓慢的、成本高的且消耗劳动的，而且它们还代表了对需要进行危险化学品的昂贵处理的试验人员的健康风险。而且，用于样品制备尤其是用于新一代分子目标的工作流程甚至变得更加复杂，且被供给多种溶液。目前，用于样品制备的各种不同的溶液被用于每一种样品类型和目标。提供可适用于易于实施的多种样品和目标、可与自动化和试剂集成相容且涉及最少的动手时间(minimalhands-on time)的标准样品制备工作流程的解决方案仍然是生命科学和诊断环境中未解决的需求。而且，样品工作流程方法学的标准化是主要在规定的诊断环境中的主要需求。样品制备的复杂性的典型说明是从复杂的血液介质中检测出目标分子或颗粒。尤其，复杂性是在低检测水平下从血液中检测出感染剂(细菌、真菌)。在临床水平下，血液感染(即败血症)的检测是尤为重要的，因为它是由对血液中的微生物感染的炎症响应所诱发的严重的医疗状况的起因。败血症确实代表重症监护病房中的死亡的最常见起因。而且，由于对来自血液的微生物的差的检测、错`过或延迟的感染剂的识别和/或缺乏或延迟的抗生素敏感试验，很多抗生素治疗形式仅以经验为主地开始，而没有适当的诊断适用范围。用于早期检测、快速微生物识别和抗生素敏感试验及充分的患者管理的败血症诊断的医学需求是高度未满足的。在微生物(例如，医院微生物)的耐药性发展增加的时候，用于快速且准确的败血症诊断的新方法学对于降低发病率和死亡率是重要的。最后，败血症感染的另一个来源是血液灌注。从血液、成分血(blood component)及血液衍生物中有效地检测出微生物对于防止污染是极其重要的。作为血液瓶子培养或血液琼脂培养的血液培养的使用仍然是检测且识别患有菌血病和败血症的患者中的感染剂的常规选择方法(黄金标准)。检测血液中的细菌细胞的主要问题是检测低至I个菌落形成单位(CFU)每毫升的细胞数目的能力。因此，在这个背景下，必须在这个数量级的检测水平下加工的血液体积必须由几毫升(5-10ml)的血液标本组成。“在干草堆中寻针”，血液感染诊断中的巨大挑战将基于允许从活的微生物或它们的核酸基因内容中提取和纯化特异性感染生物标志物的有效且易于实施的技术的可用性。例如在国际专利申请W095/15397和W02009/015484中所报道的，多次离心或过滤方法学联合特异性细胞壁/膜溶解步骤一起使用，用于从血液样品和体液中富集目标微生物。除了低的富集效率，这样的离心方法学的另一个限制是它们与常规的自动化实验室测定工作流程不相容。为了克服离心的处理限制，引入涂覆有针对目标微生物的亲和基团(affinity group)的磁性颗粒。使用磁力，颗粒将目标捕获在它们的表面上,导致目标易于从血液中分离出来。然而，对于磁珠上的亲和基团的广泛应用以捕获活细菌，存在一些主要的劣势。首先，致病微生物的范围由革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌及许多真菌物种的长列表构成；不存在覆盖所有种类的微生物的可利用的通用型亲和基团。并且，很多这样的微生物被封装，一种利于它们在血液中生存和配置(disposition)的现象。其次，已显示，微生物在血流中不一定是自由漂浮的，而是与一些血液细胞及与血小板缔合或螯合。例如，在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的情况下,相互作用的血小板及细菌与血小板的进一步螯合是允许细菌避开宿主防御体系的重要的毒力因素。从血液样品中直接富集活的微生物的可选方案由分子生物标志物(特异性的核酸基因序列)和紧接着的随后的核酸扩增技术比如PCR(聚合酶链反应)的使用构成。方法开启了传递较快结果的新的可能性。然而，检测水平(灵敏度)通常比基于培养的方法的检测水平低。分子方法的有限灵敏度主要与来自血液样品中的真核细胞(白细胞)的高背景DNA有关。基于PCR的方法的灵敏度的增加可以通过从血液样品中取出真核核酸或通过特别地浓缩微生物(原核的)DNA来实现。从这个角度，EP-A-1，400，589公开了从血液溶解产物中分离原核生物DNA的方法，该方法包括原核生物DNA与至少一种蛋白或多肽的特异性结合，之后分离这样形成的复合物的步骤。在相同的范围内，EP-A-1，861，495公开了用于从额外地包含较多的真核细胞的混合样品中所提供的微生物细胞中特异性地分离核酸的方法。该专利技术公开了核酸酶尤其是DNA-降解核酸酶的用途，该用途是用于在一种或几种离液剂和/或一种或几种表面活性剂的存在下，降解全血中的核酸，从而允许从血液溶解产物中取出真核生物核酸。两种方法都受到了以下限制:复杂方案和及时处理步骤，即在获得纯化的细菌核酸之前的半天。而且，这些方法显示出100CFU/ml的检测限，这个检测限仍显著低于血液培养 方法的灵敏度，所述血液培养方法的灵敏度按照定义为在考虑的IOml体积中的1CFU。除了现有技术中的核酸检测方法的所提及的限制外，用于检测细菌和真菌的分子方法的相关性通常是有问题的。事实上，检测血液中的循环DNA不一定与检测活的微生物的血液培养方法相关联。为了“保持”这样的相关性，一些方法提出了使用始于阳性血液培养物的基于分子的方法来识别感染剂。然而，这样的方法的临床相关性仍然受到限制，因为仍然需要耗时的培养方法。这个问题甚至是更重要的，因为分子方法在绝大多数情况下不能提供关于细菌的抗菌敏感性谱的信息，后者仍依赖于传统的培养方法。知晓这些缺点，允许血液中的快速且可靠的微生物检测和识别的新方法的开发仍然是高度相关的问题。而且，本文所提出的在血液中检测感染剂是一个典型的实例，以阐述样品制备程序的复杂性及其在通常的生物测定且尤其是药物诊断中的重大作用。用于确定目标分子或颗粒在包括食物样品、临床样品、环境样品及实验样品的各种样品中的存在的测定越来越重要。专利技术概述本专利技术涉及用于样品制备和处理，导致从周围的复杂液体介质中有效地分离出目标分子或颗粒的方法。这个方法还将允许回收优选地为起始样品体积的至少1/10的体积的高度浓缩在控制缓冲液介质(controlled buffer medium)中的所述目标。而且,所公开的方法的益处是能够达到起始样品体积的1/100到1/1000的浓缩率(concentrationrate)。此后，这样浓缩的目标可以通过另外的纯化步骤来非常容易地处理和/或使用现有技术中的方法学来直接分析。所公开的样品制备方法尤其适合与各种样品来源与广谱的体积大小一起使用。而且，使用尺寸和/或亲和力选择，根据本专利技术的分离允许从复杂的样品体积中特异性地或非特异性地分离目标颗粒或分子。因此，本专利技术公开了样品制备方法，该方法因此显示出普本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法，包括：a.通过至少部分地使包含在所述样品中的所述纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成纤维蛋白网，将所述目标分子或颗粒捕获在所述纤维蛋白网中，b.回缩所述纤维蛋白网，以形成纤维蛋白凝块，c.从周围的样品介质中分离所述纤维蛋白凝块。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.15 CH 01478/10;2010.12.07 CH 02041/10;20111.一种用于从含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法，包括: a.通过至少部分地使包含在所述样品中的所述纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成纤维蛋白网，将所述目标分子或颗粒捕获在所述纤维蛋白网中， b.回缩所述纤维蛋白网，以形成纤维蛋白凝块， c.从周围的样品介质中分离所述纤维蛋白凝块。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品内的所述纤维蛋白原的浓度为至少I μ g/ml03.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品内的所述纤维蛋白原的浓度为至少10mg/mlο4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括使所述样品经历凝血酶或凝血酶样酶。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述凝血酶包括外源性的凝血酶或凝血酶样酶。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述凝血酶包括内源性的凝血酶。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述外源性的凝血酶的浓度在0.01到IOIU每毫升样品之间。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品还包含凝血因子XIII。9.根据权利要求1所述的方法`，其中所述样品还包含钙。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品还包含选自⑶TA、EDTA和柠檬酸盐的组的螯合剂。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述凝块体积为初始样品体积的至多1/3。12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中形成的所述凝块还回缩成具有小于所述初始样品体积的1/10的尺寸的小球。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述回缩步骤是用所述样品内的活化血小板细胞或活化血小板细胞溶解产物来实现的。14.根据权利要求13所述的方法，其中用选自腺苷二磷酸和胶原的组的血小板激动剂来活化所述血小板。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述回缩步骤是用捕获在所述纤维蛋白网内且经历磁场的磁性颗粒来实现的。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述磁性颗粒被涂覆有纤维蛋白原/纤维蛋白结合部分。17.根据权利要求1和7所述的方法，其中所述外源性的凝血酶的浓度在0.01到IIU每毫升所述样品之间。18.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括溶解所述纤维蛋白凝块以回收所述目标分子或颗粒的步骤。19.根据权利要求18所述的方法，其中溶解所述凝块的所述步骤是用纤维蛋白溶解剂来进行的。20.根据权利要求18所述的方法，其中所述溶解步骤使用选自由细胞溶解酶、蛋白酶和核酸降解酶组成的组的组分。21.根据权利要求18所述的方法，其中所述溶解步骤包括洗涤剂的使用。22.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血液样品。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述血液样品选自由全血、富血小板血浆、乏血小板血浆及血清组成的组。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述血液样品是通过组合血液样品和纤维蛋白原缺乏的样品得到的人工组合的血液样品。25.根据权利要求22所述的方法，其中所述血液样品是通过组合凝血因子和纤维蛋白原缺乏的样品得到的人工组合的血液样品。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述凝血因子是纤维蛋白原。27.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)中的分离是通过将所述目标颗粒或分子尺寸选择捕获...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃玛·瑞达，尼古拉斯·梅尔莫，帕特里斯·弗兰西斯，弗拉迪米尔·拉扎雷维茨，雅克·施仁泽尔，
申请(专利权)人：斯彼诺米克斯公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH