本发明专利技术提供了一组检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物，包括：上游内部引物、下游内部引物、上游外部引物、下游外部引物、上游环引物和下游环引物，其序列依次如序列表SEQ ID No.1-6所示。本发明专利技术还提供了包含该组引物的检测猪流行性乙型脑炎病毒的可视化试剂盒及利用该试剂盒检测非活体样品上是否含有猪流行性乙型脑炎病毒的方法。本发明专利技术提供的引物、试剂盒和检测方法，优化了反应体系，结果判定实现了可视化，对猪乙型脑炎检测诊断防治具有较大意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及猪感染乙型脑炎病毒的快速检测试剂盒及引物。
技术介绍
流行性乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),简称乙脑病毒，所引起的疾病简称乙脑，乙脑是一种人畜共患的病毒性传染病，可以感染人类和多种动物，可以导致人的中枢神经系统疾病和猪的繁殖障碍，严重危害着人类的健康和畜牧业的发展。乙脑病原学实验室诊断方法可以检测病例的脑组织、胎儿、胎盘以及体液等中的病毒抗原。目前的诊断方法有:免疫细胞化学法、反向被动血凝试验、荧光抗体染色法和RT-PCR技术。日本长崎大学运用基因扩增的传统方法，发展了实时环介导逆转录等温扩增技术(reverse transcription loop-mediatedisothemal amplification,RT-LAMP),检测JEV的敏感性可以达到IPFU。然而，上述现有技术仍存在着缺点和不足:①实验结果的判断不够迅速直观需要贵重仪器设备，不利于推广检出效率还不够高。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是，针对上述现有技术存在的缺陷提供一种可以用肉眼迅速判定实验结果，并利用环引物加强反应的检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案:—对检测猪流行性乙型脑炎病毒的环引物，其应用于环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)中，其特征在于，该对环引物包括:上游环引物(FL)，其序列如序列表SEQ ID N0.5 所示:5’-CAGAAITTTCCTGGnTTCCCTGA-3’ ；下游环引物(BL)，其序列如序列表SEQ ID N0.6 所示:5’-GGTGGTAGCAGCAGAAATGGCA-3，。一组检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物，其应用于环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)中，其特征在于，该组引物包括:上游内部引物(FIP)，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示:5’ -CGCTGCTGGATAGCGTCCTT GAATTCGTGC TAGATTTGCA CCCTGG-3’ ；下游内部引物(BIP)，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示:5’ -AAGAACAGCTGTGTTGGCAC CGGATATCGT ACTGGGAGCC CT-3’ ；上游外部引物(F3)，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示:5’ -ACACCCCAAACATGTTGAGA-3’ ；下游外部引物(B3)，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示:5’ -CTCTCTGCACTGCTGAAGTT-3’ ；上游环引物(FL)，其序列如序列表SEQ ID N0.5 所示:5’-CAGAAITTTCCTGGnTTCCCTGA-3’；下游环引物(BL)，其序列如序列表SEQ ID N0.6 所示:5’-GGTGGTAGCAGCAGAAATGGCA-3，。检测猪流行性乙型脑炎病毒的可视化试剂盒，其特征在于，其组成为:10 X Thermopol 反应缓冲液；10mmol /T, dNTPs ；乙脑病毒总RNA ；上游内部引物FIP，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示；下游内部引物BIP，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示；上游外部引物F3，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示；下游外部引物B3，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示；上游环引物FL，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示；下游环引物BL，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示；Bst DNA聚合酶大 片段；AMV反转录酶；20 X SYBR Green I ；DEPC ddH20。如上所述的可视化试剂盒在非活体样品的猪流行性乙型脑炎病毒检测中的应用，其特征在于，其步骤为:(I)在反应管中加入以下组分并混匀:10 X Thermopol 反应缓冲液，2.5 U L ；待测样品总RNA5.25 U L，阳性对照反应管中则加入阳性样品总RNA5.25 U L ；8U/管Bst DNA聚合酶大片段，IuL ；AMV 反转录酶 0.25 ii L ;10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ；20pmol/管上游内部引物，0.8iiL ;20pmol/管下游内部引物，0.8iiL ;5pmol/管上游外部引物,0.2 ii L ;5pmol/管下游外部引物,0.2 ii L ;20pmol/管上游环引物，0.L ;20pmol/管下游环引物，0.L ;DEPC ddH20 补齐至 25 ii L ;(2)置于42°C下保温30min，进行逆转录反应；(3)置于6(T65°C下保温3(T90min，进行LAMP扩增反应；(4)置于 80°C下 IOmin,灭活 Bst DNA 聚合酶；(5)悬置I ii L20XSYBR Green I于反应管盖，将之弹入反应液中并混匀；(6)将反应管置于紫外透射仪下，可见绿色荧光产生则待测样品为阳性。如上所述的应用，步骤(4)后得到的LAMP扩增反应产物也可以利用凝胶成像系统进行检测，其特征在于:在检测时，使用TAE/TBE缓冲液试验伴侣配制琼脂胶，添加约20g/LGoldView 核酸染料染色，对反应产物进行电泳检测，电泳(260V/2000mA)约45分钟，观察结果，出现如图4所示的特异条带则待测样品为阳性。本专利技术的有益效果为:本专利技术提供了一种猪乙型脑炎病毒诊断环引物加强型可视化试剂盒，同时提供了一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段。本专利技术设计并使用了 RT-LAMP引物和环引物，优化反应体系，结果判定实现可视化，环引物加强反应。对猪乙型脑炎检测诊断防治具有较大意义。附图说明图1为NS3基因保守区LAMP扩增结果。图2为LAMP扩增后产物的可视化结果，a为可见光下的结果，b为紫外光下的结果。图3为LAMP扩增后产物的酶切鉴定结果。图4为不同反转录时间的LAMP扩增结果。图5为不同反应时间LAMP扩增的结果。图6为NS3基因的LAMP检测特异性凝胶成像结果。图7a、b、c依次为RT-LAMP、RT-PCR和荧光RT-PCR的检测结果图。图8为乙型脑炎病毒检测实时RT-LAMP荧光走势图。具体实施例方式一、JEV NS3基因保守区的LAMP扩增:以JEV总RNA为模板，用本专利技术提供的引物进行JEV NS3基因保守区的扩增，反应体系为:25 U L反应体系中含有:IOXThermopol 反应缓冲液(NEB 公司)，2.L ；JEV 总 RNA5.25 U L ；8U/管Bst DNA聚合酶大片段(NEB公司)，IiiL;AMV 反转录酶(NEB 公司)0.25 ii L ;10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ；20pmol/ 管上游内部引物(FIP)，0.8 ii L ；20pmol/ 管下游内部引物(BIP)，0.8 ii L ；5pmol/ 管上游外部引物(F3)，0.L ；5pmol/ 管下游外部引物(B3)，0.2 ii L ；20pmol/ 管上游环引物(FL)，0.4 ii L ； 20pmol/ 管下游环引物(BL)，0.4 ii L ；(上述引物均为宝生物工程(大连)有限公司合成)DEPC ddH20 补齐至 25 ii L。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一对检测猪流行性乙型脑炎病毒的环引物，其特征在于，该对环引物包括：上游环引物，其序列如序列表SEQ ID No.5所示；下游环引物，其序列如序列表SEQ ID No.6所示。
【技术特征摘要】
1.一对检测猪流行性乙型脑炎病毒的环引物，其特征在于，该对环引物包括: 上游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示。2.一组检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物，其特征在于，该组引物包括: 上游内部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 下游内部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示； 上游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示； 下游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示； 上游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示。3.检测猪流行性乙型脑炎病毒的可视化试剂盒，其特征在于，其组成为: IOXThermopol反应缓冲液；`10mmol /T, dNTPs ； 乙脑病毒RNA ； 上游内部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 下游内部引物，其序列如序列`表SEQ ID N0.2所示； 上游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示； 下游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示； 上游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示； Bst DNA聚合酶大片段； AMV反转录酶； ...
【专利技术属性】
技术研发人员：林志雄，田纯见，何晓明，罗琼，鱼海琼，罗长保，陈茹，刘志玲，王宏，吴晓薇，毕英佐，马静云，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。