一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法。该方法采用自行设计的绵羊肺炎支原体热休克蛋白70（HSP70）基因序列的种属特异性引物，进行种属特异性PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析，建立绵羊肺炎支原体的简便、快速、准确的定性检测方法。本发明专利技术可用于绵羊肺炎支原体的快速诊断，具有特异性强、重复性好、灵敏度高和易于标准化的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物传染病诊断，具体涉及检测绵羊肺炎支原体的PCR方法

技术介绍
绵羊肺炎支原体可引起绵羊及山羊发生非典型肺炎。临床上以咳嗽、流鼻涕、渐进性消瘦和增生性间质性肺炎为主要特征( Besser T E, Cassirer E F，Potter K A, etal.Association of Mycoplasma ovipneumoniae infection with population-limitingrespiratory disease in free-ranging Rocky Mountain bighorn sheep ( OvisCanadensis canadensis).J Clin Microbiol，2008，4 6:423 430. ParhamKj Churchward C P，McAuliffe L，et al.A high level of strain variation withinMycoplasma ovipneumoniae population of the UK has implications for diseasediagnosis and management.Vet Microbiol，2006，118:83 90.)。目前绵羊肺炎支原体在全球范围内分布，在我国流行十分广泛，给养羊业生产造成了巨大的经济损失(Patel H，Mackintosh Dj Ayling RDj et al.A novel medium devoid of ruminantpeptone for high yield growth of Mycoplasma ovipneumoniae.Vet Microbiol,2008，127 (3 4):309 314.王华，杨发龙，王永，汤承.四川省山羊支原体性肺炎流行病学调查，中国畜牧兽医，2011，38(1): 210-213.)。迄今为止，有关绵羊肺炎支原体的病原学诊断集中在病原的分离鉴定和聚合酶链式反应(PCR)等方面。由于支原体生长的营养需求较高，且生长较为缓慢，给病原的分离鉴定带来困难。随着现代分子生物学的飞速发展，PCR方法因其具有快速、特异、灵敏的优势，已成为检测病原的常规技术手段，但长期以来由于绵羊肺炎支原体基因序列的缺乏，目前绵羊肺炎支原体的分子检测方法只有 McAuliffe L 根据 16S rRNA 建立的 PCR 方法的报道( McAuliffe Lj HatchellFM，Ayling RDj et al.Detection of Mycoplasma ovipneumoni ae in Pasteurella-vaccinated sheep flocks with respiratory disease in England.Vet Recj2003，153(22):687 688.)，该方法具有较好的特异性，但在实际应用于临床样本检测时发现灵敏性不高。另外，大量研究表明绵羊肺炎支原体在核酸水平和蛋白水平均存在高度的异质性，并且其基因组中G+C含量低，因此给分子检测靶点的选择造成很大困难( 1nas G，Norman NGj Clarke JKj Marshall RB.A study of the heterogeneity of isolatesof Mycoplasma ovipneumoniae from sheep in New Zealand.Vet Microbiol.1991Nov;29(3-4):339-47; Parham K，Churchward CPj McAuliffe Lj Nicholas RA，Ayling RD.A high level of strain variation within the Mycoplasma ovipneumoniaepopulation of the UK has implications for disease diagnosis and management.VetMicrobiol.2006 Nov 26;118(1-2):83-90.)。 热休克蛋白70 (HSP70)是一个高度保守的蛋白质，它存在于从细菌到人体的所有有机体中。本专利技术克隆测序了 15株绵羊肺炎支原体HSP70基因，并对其结构和序列进行了详细的生物信息学分析发现，在I 300bp和1400 1818 (1815) bp这两个区域内，绵羊肺炎支原体HSP70与其他感染羊的支原体的种间差异较大，但种内保守，GC含量较高，可作为候选的分子诊断靶点。本专利技术根据这两个区域的序列，自行设计5对HSP70基因序列的种属特异性引物进行试验，最终筛选出一对特异性引物，应用此引物进行种属特异性PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析，建立绵羊肺炎支原体的简便、快速、准确的定性测定方法。
技术实现思路
鉴于现有技术的以上不足，本专利技术的目的是提供，使之能克服现有技术的缺点。 本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的。本专利技术涉及。该方法的步骤如下: A.模板DNA的制备 (1)取IOOg组织进行勻衆，再把勻衆后的组织4000r/m离心5min,取上清，上清11000r/m离心30min，弃上清；若是细菌培养物，则取Iml细菌培养物于1.5ml离心管中，11000r/m离心30min,弃上清； (2)取500μ STE悬浮沉淀，加入20μ 10% SDSUOPL 10mg/mL蛋白酶K，混匀后于56°C水浴消化1.5h ； 所述的STE提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。所述的SDS是十二烧基硫酸钠,它能与蛋白质结合,使蛋白质变性而沉淀下来。所述的蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的降解。这种酶经纯化去除了 RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛。(3)加入与在步骤(2)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，他们的体积比是 25:24:1,混勻，10000r/m 离心 5min ；所述的异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。(4)离心后步骤(3)获得的溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相，吸取上层水相，加入与所述水相等体积的异戊醇-氯仿混合物，混匀后10000r/m离心3min，取上清液； (5)往上述上清液中加入0.1倍体积的5mol/L NaCl和2倍体积的无水乙醇，混合均匀，10000r/m离心3min,得到DNA沉淀； (6)所述沉淀用70%(体积比)乙醇水溶液洗涤，10000r/m离心lmin，弃乙醇，在室温下自然干燥，得到模板DNA，然后加入30μ 灭菌去离子水溶解沉淀,于_20°C保存备用； B.PCR扩增反应体系 25μ : 10XPCR buffer 2.5PL，25mM Mg2+ 1.5μ , 2.5mM dNTPs 2μ ，10μΜ上下游引物各lKL，5υ/μ Taq酶0.125μ ，50ng/^L DNA模板2μ ，灭菌双本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法，其特征在于该方法的步骤如下：A. 模板DNA的制备（1）取100g组织进行匀浆，再把匀浆后的组织4000 r/m离心5min，取上清，上清11000r/m离心30min，弃上清；若是细菌培养物，则取1ml细菌培养物于1.5ml离心管中，11000r/m离心30min，弃上清；（2）取500µL STE悬浮沉淀，加入20µL 10% SDS、10µL 10mg/mL蛋白酶K，混匀后于56℃水浴消化1.5h；（3）加入与在步骤（2）得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，他们的体积比是25:24:1，混匀，10000r/m离心5min；（4）离心后步骤（3）获得的溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相，吸取上层水相，加入与所述水相等体积的异戊醇‑氯仿混合物，混匀后10000r/m离心3min，取上清液；（5）往上述上清液中加入0.1倍体积的5mol/L NaCl和2倍体积的无水乙醇，混合均匀，10000r/m离心3min，得到DNA沉淀；（6）所述沉淀用70%（体积比）乙醇水溶液洗涤，10000r/m离心1min，弃乙醇，在室温下自然干燥，得到模板DNA，然后加入30µL灭菌去离子水溶解沉淀，于‑20℃保存备用；B. PCR扩增反应体系25µL： 10×PCR buffer 2.5µL，25mM Mg2+  1.5µL， 2.5mM dNTPs 2µL，10µM上下游引物各1µL， 5U/µL Taq酶 0.125µL，50ng/µL DNA模板 2µL，灭菌双蒸水补足至25µL；PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃终延伸10min，16℃结束反应；取5µL PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并使用凝胶成像系统进行电泳图谱分析。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：岳华，汤承，杨发龙，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川;51