本发明专利技术提供一种TMC1耳聋突变基因筛查方法，所述方法包括(1)提取外周血白细胞DNA；(2)以外周血白细胞DNA为模板，以上游引物：TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC下游引物：AACCTGGGAGGCTTTTCTGT进行PCR扩增，(3)以限制性内切酶Sal 1酶切所述PCR扩增产物，得到160bp，130bp，30bp三条带即为TMC1耳聋基因阳性突变样本。本发明专利技术的有益效果在于，易于实现，操作简单，成本低，准确率高，解决了TMC1c.1714G＞A热点难以进行人群大规模筛查的难题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因突变筛查方法，具体涉及一种TMCl耳聋基因突变筛查方法。
技术介绍
研究表明，60%耳聋由遗传因素导致，另外40%与环境因素有关。以往由于人们缺乏对耳聋遗传病因学的深入认识以及诊断技术，无法明确耳聋分子病因，更无法预防其发生。近30年来，伴随耳聋遗传病因学及分子生物学技术的快速发展，至今已有84个耳聋基因被克隆，一些常见基因得到了深入的认识，耳聋分子病因学诊断成为可能。虽然欧美自上世纪末开展了耳聋基因诊断工作，但因缺乏对中国耳聋人群致聋遗传因素的系统性研究，并缺乏符合中国国情及遗传背景的耳聋基因筛查及诊断工具，我国临床耳聋基因诊断工作受到严重限制而远远滞后。TMCl基因突变可以引起常染色体显性及隐性耳聋。如“耳聋相关基因TMC1”(《国际耳鼻喉头颈外科杂志》，2008年第05期)中报道，TMCl基因突变具有常染色体隐性遗传和显性遗传两种遗传方式，相对应出现两种截然不同的听力表型特征，正逐渐为听力学家、遗传学家和耳科学临床工作者所关注。研究表明:TMClc.1714G>A(p.D572N)是引起常染色体显性遗传性耳聋的热点突变，近期的研究也在中国发现了携带该突变的耳聋家庭。由于该突变区域缺乏酶切位点，不能进行酶切反应，因此目前国际上检测该突变主要是采用Sanger测序法。此方法成本较高，限制了该突变的大规模人群筛查。专利技术目的有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种TMCl耳聋基因突变筛查方法，该方法简单、快速、经济，解决了 TMClc.1714G > A(p.D572N)热点难以进行人群大规模筛查的难题。本专利技术提供的一种TMCl耳聋突变基因筛查方法，所述方法包括(I)提取外周血白细胞DNA; (2)以外周血白细胞DNA为模板，以上游引物:TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC下游引物:AACCTGGGAGGCTITTCTGT进行PCR扩增，(3)以限制性内切酶Sal I酶切所述PCR扩增产物，得到160bp，130bp，30bp三条带即为TMCl耳聋基因阳性突变样本。进一步，酶切所述PCR扩增产物的反应条件为:37°C，4小时。进一步，所述PCR扩增产物酶切后以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。进一步，所述PCR扩增产物酶切后以8%聚丙烯凝胶电泳鉴定。本专利技术的有益效果在于:(1)易于实现:本专利技术技术方法不需要特殊昂贵设备，且能较快定购到实验所需试剂，实验前期准备时间短；(2)操作简单:按照分子生物学试验室的程序化操作即可完成。(3)成本低:所引入的限制性内切酶Sal I是普通常用酶，价格低廉(500U/80元)，每例样品检测需1U,加上凝胶、电泳液、酶切体系的配制,酶切反应成本约为3元/例，而传统的Sanger测序法成本为25元/例。(4)准确率高:检测结果与Sanger测序法结果完全吻合，无假阴性、假阳性。(4)解决了难题:鉴于以上优点，该技术可在基层单位广泛开展，解决了TMClc.1714G > A(p.D572N)热点难以进行人群大规模筛查的难题。本专利技术通过在引物设计中对突变位点上游第三位碱基进行修改，引入了 Sal I酶切位点，修饰了上游引物，采用修改后的引物进行PCR反应，扩增产物可采用酶切法对突变进行鉴定，大大降低了检测成本。野生型样本(即非突变样本)酶切后为两条带130bp，30bp，杂合突变型样本(即阳性突变样本)为三条带160bp，130bp，30bp，易于对比鉴定。附图说明:图1:2%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切扩增产物。凝胶电泳结果，Iane1，21 为 PCR 产物；Iane 2，3，4，6，7，8，9，10，11，12，14，16，17，18，19，20，22，23，24 为野生型；lane 5，13，15 为突变型图2:野生型和突变型酶切后的样本琼脂糖凝胶电泳结果判读示意图。图3:野生型和突变型酶切后的样本Sanger测序验证。具体实施方式:实施例11、模板DNA:提取自外周血白细胞中DNA，2、PCR反应体系权利要求1.一种TMCl耳聋基因突变筛查方法，其特征在于:所述方法包括(I)提取外周血白细胞DNA; (2)以外周血白细胞DNA为模板，以 上游引物:TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC 下游引物:AACCTGGGAGGCTITTCTGT 进行PCR扩增，(3)以限制性内切酶Sal I酶切所述PCR扩增产物，得到160bp，130bp，30bp三条带即为TMCl耳聋基因阳性突变样本。2.按照权利要求1所述的TMCl耳聋基因突变筛查方法，其特征在于:酶切所述PCR扩增产物的反应条件为:37°C，4小时。3.按照权利要求1所述的TMCl耳聋基因突变筛查方法，其特征在于:所述PCR扩增产物酶切后以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。4.按照权利要求1所述的TMCl耳聋基因突变筛查方法，其特征在于:所述PCR扩增产物酶切后以8%聚 丙烯凝胶电泳鉴定。全文摘要本专利技术提供一种TMC1耳聋突变基因筛查方法，所述方法包括(1)提取外周血白细胞DNA；(2)以外周血白细胞DNA为模板，以上游引物TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC下游引物AACCTGGGAGGCTTTTCTGT进行PCR扩增，(3)以限制性内切酶Sal 1酶切所述PCR扩增产物，得到160bp，130bp，30bp三条带即为TMC1耳聋基因阳性突变样本。本专利技术的有益效果在于，易于实现，操作简单，成本低，准确率高，解决了TMC1c.1714G＞A热点难以进行人群大规模筛查的难题。文档编号C12Q1/68GK103103257SQ201210579480公开日2013年5月15日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日专利技术者高雪, 戴朴 申请人:中国人民解放军总医院本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种TMC1耳聋基因突变筛查方法，其特征在于：所述方法包括(1)提取外周血白细胞DNA；(2)以外周血白细胞DNA为模板，以上游引物：TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC下游引物：AACCTGGGAGGCTTTTCTGT进行PCR扩增，(3)以限制性内切酶Sal 1酶切所述PCR扩增产物，得到160bp，130bp，30bp三条带即为TMC1耳聋基因阳性突变样本。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高雪，戴朴，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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