本发明专利技术一种登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列，试剂盒含有纳米磁性微粒，用于分离提取登革2型病毒RNA，所述纳米磁性微粒为表面包裹了硅羟基的Fe3O4纳米粒子。本试剂盒将纳米磁微粒分离核酸技术与实时荧光定量PCR技术有机结合，在标本核酸提取方面具有操作方便、快捷、高效的特点，尤其在提取微量核酸方面具有很大优势，实现了最大程度降低漏检率的目标，本试剂盒的检测限可以达到29copies/μl。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于检验检疫领域，涉及检测临床样品中登革热病原体登革病毒(DengueVirus，DV)2型(DV-2)，是一种登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列。
技术介绍
登革病毒(dengue virus，DV)是以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，引起登革热(dengue fever, DF)和登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)或登革休克综合征(dengue shock syndrome, DSS)的病原体。每年的登革病毒感染者超过I亿,登革病毒感染已成为全球严重的公共卫生问题。登革热主要流行于全球热带和亚热带地区。目前除欧洲以外所有大陆均有登革热的流行，尤其是东南亚、太平洋岛屿和加勒比海地区最为严重，我国主要是海南、广东、广西、台湾、福建等南方沿海地区。目前，全球登革热疫情不容乐观，必须加强对登革热在内的各种虫媒病毒病的控制和研究。随着人群对登革病毒一种血清型的自然免疫力的逐渐消退，以及登革病毒基因型多样性的增加和毒力增强变异株的出现，可能引起新的DF/DHF流行和暴发疫情，因此，做好登革热病例的早期检测、媒介监测等方面的研究至关重要。登革病毒的自然宿主是人、某些低等灵长类动物和蚊。患者是主要传染源。一般在发病前一天至发病后第3 5日内传染性最强。在流行期间还有众多的轻型患者和隐性感染者，也是重要的传染源。人群对登革病毒普遍易感，感染后对同型病毒株有巩固的免疫力，并可维持多年，但对异型登革病毒仅有短暂的交叉免疫，故临床上有患两次以上登革热的可能。DV是黄病毒属的单股正链RNA病毒，根据登革病毒E蛋白不同的抗原特性，利用血清中和试验将其分为1、2、3 和4型四种血清型。当前世界范围内DV-2和DV-3是流行优势株，并可以发生复合感染。DV的四个血清型(DV-1、DV-2、DV-3和DV-4)，任何一种DV感染均可导致登革热(DF)、登革出血热(DHF)或登革体克综合征(DSS)。登革病毒在人体中，主要在单核-吞噬细胞内生长繁殖，在感染早期可出现特异性IgM抗体，4-5d后出现血凝抑制抗体，S-1Od后出现中和抗体。IgG抗体可维持5-15年。人初次感染登革病毒后，可表现为隐性感染或一般的发热，症状不明显；机体可对同型病毒产生免疫力，而且可能持续终生，但对异型病毒感染的保护作用持续时间较短。初次感染登革病毒后二次感染异型登革病毒易发生登革出血热和登革休克综合征。由于缺乏有效的同时针对四个血清型DV的疫苗，早期诊断成为降低DHF和DSS发病率和死亡率的关键。此外，DV感染的临床症状无特异性，很难与其他的急性发热疾病，如疟疾、黄热病、西尼罗热及地方性脑炎等热带病相区别。对确定有DHF/DSS症状的病人，及时有效的医疗护理成为减轻症状、避免死亡的唯一有效措施。因此，在疾病的早期，对不明原因的急性发热疾病和出血热进行鉴别诊断显得特别重要。目前登革病毒诊断方法主要包括病毒分离、分子生物学检测和血清学检测。其中，病毒分离作为登革病毒诊断的金标准，不但可以检出病毒的存在，还能对病毒的型别进行鉴定，但该方法耗时，灵敏度低，而且需要特殊的仪器设备和专业技术人员。从Banditti早期报道的巢式RT-PCR检测到现在实时荧光PCR检测的应用，分子生物学检测技术最近十几年来有了较大的发展。目前，对DV感染的早期诊断、分型诊断以及区分其他相关黄热病毒的感染中，分子诊断技术在很大程度上代替了传统的病毒分离方法。分子生物学检测技术的发展，为登革热的早期诊断提供了可能。应用普通RT-PCR方法可在Id内进行登革病毒的鉴定和分型诊断，但该方法易造成标本间的交叉污染而得到假阳性结果，因而在使用上受到一定限制。实时荧光定量PCR技术是1996年首次由美国Applied Biosystems公司推出的，与传统的PCR技术相比，实时定量PCR检测方法实现了低拷贝数靶基因的定量分析，而且还具有特异性和敏感性更强、自动化程度更高以及污染可能性更小等优点。 作为一种新的核酸检测方法，实时荧光PCR技术已广泛应用于转基因检测、药物疗效评价、基因表达研究、传染病诊断等诸多领域，是目前国际公认的最灵敏、特异、重复性最好的核酸定性、定量检测方法。国内外已有多篇文章报道采用TaqMan实时荧光定量PCR技术检测登革病毒。随着技术的发展，实时荧光定量PCR正取代传统PCR，成为急性期患者血标本快速诊断登革病毒感染的新标准。与传统的PCR相对比，TaqMan实时荧光定量PCR技术依据目的基因设计合成了一条能够与之特异性杂交的探针，探针结合位置位于上下游引物之间，当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5’ 一 3’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上解离下来，破坏了两个突光基团之间的突光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer，FRET )，而发出荧光，解离下来的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此根据反应体系中的荧光强度即可计算初始模板的数量。这项新技术对于早期发现登革热病人十分有利。研究表明，在患者出现症状的第7d，采用免疫学检测，血清IgM抗体疑似阳性，第13d呈阳性，而采用实时荧光定量PCR检测，第2d血清中检出登革病毒，应用这项新技术可以实现登革热病人的早期诊断。DV的实时荧光定量PCR检测，包括两大步骤，首先是从各种标本中将DV病毒的核酸提取出来，然后再用实时荧光定量PCR技术对目的基因进行检测。DV是RNA病毒，病毒核酸极易在标本处理的过程中降解，而导致假阴性的检测结果，导致DV的漏检。传统的核酸分离方法，不仅需接触有毒试剂，而且步骤繁杂、费时、费力，难以自动化操作；现有的商业化核酸提取试剂盒，通常价格昂贵，不适合现场大批量使用。纳米磁微粒(MNP)是一种优良的磁性分离介质，具有比表面积大,磁响应性强,可应用于生物大分子(如蛋白质、核酸等)的快速分离提取，尤其是其表面进行化学修饰或高分子化合物包裹后，分离提取效率可大为提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种快速高效、灵敏度高、操作方便、快捷的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒。本专利技术还提供一种与该特异性强、灵敏度高的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测相关的核苷酸序列。本专利技术实现目的的技术方案如下:本专利技术建立了登革病毒的纳米磁分离的核酸提取纯化技术；设计了登革2型病毒特异的引物和探针，优化了实时荧光PCR检测体系；针对登革2型病毒自身的序列特征和实时荧光PCR反应引物和探针的序列特征，设计了另外一对引物用于构建质粒标准品，结合普通PCR技术和分子克隆技术，构建了登革2型病毒质粒标准品，建立了目的基因拷贝数与荧光检测信号之间关系的标准曲线，实现了登革2型病毒的实时荧光定量检测，具体如下:一种登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒含有Fe3O4纳米磁性微粒，用于分离提取登革2型病毒RNA，所述的Fe3O4纳米磁性微粒为表面硅羟基改性的Fe3O4纳米粒子。而且，所述Fe3O4纳米磁微粒分离提取登革2型病毒RNA的步骤如下:⑴取10 μ I纳米磁微粒MNP(25 μ g/μ I)溶液，用磁铁吸附MN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：试剂盒含有Fe3O4纳米磁性微粒，用于分离提取登革2型病毒RNA，所述的Fe3O4纳米磁性微粒为表面硅羟基改性的Fe3O4纳米粒子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘翌，孙宁，王飞，周小平，杨秀娟，孙福军，邓丛良，葛广路，秦成峰，陆琳，汪琳，张绍福，柏亚铎，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：北京;11
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