本发明专利技术提供了一种新型的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI49，采用重叠肽的方法，找到丙型肝炎病毒包膜蛋白新的线性保护性B细胞表位肽，并获得了能够中和丙型肝炎病毒1b基因亚型HCVpp的保护性抗体，这些抗体识别的表位肽，其氨基酸组成为FTIFKVRMYVGGVEHRLNAA，位置为624-643（以丙型肝炎病毒H77为参考标准，Accession No.NC–004102）。该保护性B细胞表位肽的确定，为HCV治疗性抗体的研发和HCV预防性疫苗的研发提供了新的解决方案。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学领域，具体地说，涉及丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI49及其应用。
技术介绍
丙型肝炎病毒(Ifepatitis C virus，HCV)为单股正链RNA病毒，隶属于黄病毒科。HCV基因组包括一个单一的长开放阅读框编码约由3000个氨基酸残基组成的聚合蛋白。聚合蛋白在细胞和病毒蛋白酶的作用下，裂解为三种主要结构蛋白和几种病毒复制必须的非结构蛋白。HCV基因组高度变异，高度变异的分离株之间仅有60%核苷酸序列是同源的。HCV目前可分为6个基因型及不同亚型，HCVlb和2a基因型在我国较为常见，其中以Ib型为主。某些地区有la、2b和3b型报道，6型主要见于香港和澳门地区，在南方边境省份也可见此基因型。目前全球约有1.8亿人感染了 HCV，其中约80%的感染者会慢性化，进而发展为肝硬化和肝细胞性肝癌。在我国，HCV慢性感染者约为650万。针对HCV慢性感染，最主要的治疗方式为干扰素联合利巴韦林的标准化治疗，但针对基因I型和4型治疗效果较差,且因毒副作用明显，治疗费用较高，而使大量HCV感染者被迫放弃治疗。由HCV感染导致的肝移植在西方国家已成为肝移植手术的最主要原因，在我国亦是重要原因之一，而标准化治疗方案对阻断HCV感染导致的移植肝脏再感染疗效较差，迫切需要新的预防、治疗方案。目前，已鉴定出较多的针对HCV包膜蛋白的保护性B细胞表位，例如313-327、396-407,412-423和613-621等，这些表位相应的抗体针对HCV具有较好的中和活性。研究较多的一条保护性线性B 细胞表位肽412-423 (QLINTNGSWHIN)，其相应的抗体，命名为HCVI,已完成临床二期实验，在黑猩猩动物模型中，250mg/kg HCVl能完全阻断HCV代表株H77 (Ia基因亚型)的感染。这表明在HCV感染导致的肝移植领域，该抗体在阻断移植肝脏HCV的再感染方面应用前景广阔，在HCV疫苗的研制方面，也有较为广阔的应用前景。一系列实验表明，保护性表位的鉴定，在HCV感染的预防和治疗领域，都具有十分广阔的应用前旦o
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI49及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI49，其氨基酸组成为 FTIFKVRMYVGGVEHRLNAA。本专利技术是将已报道的中国人Ib基因亚型HCV分离株包膜蛋白序列进行序列比对，找出包膜蛋白全长的共识序列。应用重叠肽的方法，将HCV包膜蛋白全长(共识序列)，即从第192位氨基酸至第746位氨基酸(以丙型肝炎病毒H77为参考标准，AccessionN0.NC_004102)，拆分为57条不同的多肽(不包括跨膜区)，其中序列192_35、384_413、444-523、544-613和624-717中，每条多肽长度为20个氨基酸，相邻多肽重叠10个氨基酸；序列404-453、514-553和604-633中，每条多肽长度为15个氨基酸，相邻多肽重叠10个氨基酸。通过人工合成法合成这些多肽，分别将这些多肽免疫Balb/c小鼠，以获取多克隆抗体(抗血清)，共免疫3次，每次间隔2周，50y g/次。将获得的多克隆抗体进行效价检测，方法包括间接 ELISA (参考文献:Ndongo N, Berthillon P, Pradat P, Vieux C, BordesI,BerbyF, Maynard M, Zoulim F, Trepo C，Petit MA.Hepatology2010;52:1531-1542.)。将血清按比例稀释为 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000 和1:128000八个浓度，在1:128000稀释比例下，490nm处OD值彡0.25，且1:128000稀释浓度时多克隆抗体OD值与阴性对照孔OD值比值> 2，被判定为多克隆抗体效价合格。将获得的HCV多克隆抗体，进行HCV假病毒颗粒(HCV-pseudotyped particles, HCVpp)中和实验，方法包括包装具有荧光素酶报告基因的la、lb、2a、3a、4a、5和6共七种不同基因型/亚型的 HCVpp (参考文献:TongY，ZhuY，Xia X, LiuY, FengY, HuaX, Chen Z1Ding H, Gao L, WangY,Feitelson MA, Zhao P，Qi ZT.JVirol，2011; 85:2793-2802.)，然后将 57 种 HCV 多克隆抗体，分别按不同的稀释比例，与七种不同基因型/亚型的HCVpp分别混合，然后加入至预接种Huh7.5细胞的96孔板中，72小时后检测荧光素酶活性，并与对照孔进行比较，以确定不同多克隆抗体中和HCVpp的活性(参考文献:Tarr AW, Urbanowicz RA, Jayaraj D, BrownRJ, McKeating JA, Irving WL, Ball JK.J Virol2012; 86:2739-2749.)，进而确定保护性 B细胞表位肽。实验结果表明，序列624-643 (以丙型肝炎病毒H77为参考标准，AccessionN0.NC - 004102)为保护性B细胞表位肽，相应的氨基酸组成为FTIFKVRMYVGGVEHRLNAA，将其命名为PUHI49，其相应的多克隆抗体能中和Ib基因亚型HCVpp。本专利技术还提供所述丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI49在制备抗HCV药物及HCV预防性疫苗中的应用。以PUHI49表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物(如Balb/c小鼠)，制备多克隆抗体。或者， 以PUHI49表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术和DNA重组技术，制备出识别PUHI49表位肽抗原的人源化单克隆抗体。将以上制得的多克隆抗体或单克隆抗体单独或联合用于阻断Ib基因型慢性HCV感染者肝移植术中及术后HCV再感染。本专利技术进一步提供HCVlb基因亚型中和性抗体，其是以所述的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI49为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物(如Balb/c小鼠)，制备的多克隆抗体。前述的中和性抗体，将PUHI49表位肽分别与载体蛋白KLH和BSA偶联(其中，BSA偶联表位肽用于免疫完成后Balb/c小鼠血清抗体滴度检测)(参考文献=DarwishIA, Alzoman NZ, Abuhejail RM, El-Samani TE.Chem Cent J2012; 6:125.), KLH 偶联表位月太抗原和佐剂按等体积混合，乳化后，采用皮下注射法分3次免疫Balb/c小鼠，免疫完成后，收集血清中的抗体，即得。具体地，将PUHI49表位肽分别与载体蛋白KLH和BSA偶联(其中，BSA偶联表位肽用于免疫完成后Balb/c小鼠血清抗体滴度检测)，KLH偶联表位肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化完全后，分别于第I天、15天、29天以颈背部多点皮下注射法免疫8-12周龄的Balb/c小鼠，共免疫3次，第一次使用氟氏完全佐剂，后两次使用不完全氟氏佐剂，每只小鼠每次注射500 ii I乳化后抗原，抗原量为50 ii g，免疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI49，其特征在于，其氨基酸组成为FTIFKVRMYVGGVEHRLNAA。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏来，刘如玉，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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