本发明专利技术提供一种在细胞中制造在特定位置处具有所选氨基酸的抗体或抗体片段多肽的方法。本发明专利技术所述的方法包含：使所述细胞在适当培养基中生长，其中所述细胞包含核酸，所述核酸包含至少一个选择性密码子并且编码多肽；和提供所述所选氨基酸；其中所述细胞另外具有：正交tRNA（O-tRNA），其在所述细胞中起作用并且识别具有选自由SEQ ID NO:2及其互补聚核苷酸序列编码的序列组成的群组的核酸序列的选择性密码子；和正交氨酰基tRNA合成酶（O-RS），其中所述O-RS利用所述所选氨基酸使所述O-tRNA氨酰基化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及翻译生物化学领域。本专利技术涉及制造tRNA的方法和tRNA组合物以及其用途。本专利技术还涉及使用所述tRNA和相关组合物 在细胞中制造蛋白质的方法。
技术介绍
从细菌到人类，每一种已知有机体的遗传密码都编码相同的二十种常见氨基酸。这二十种相同天然氨基酸的不同组合形成进行几乎所有生命复杂过程(从光合作用到信号转导和免疫反应)的蛋白质。为研究和改变蛋白质结构和功能，科学家们已尝试操纵蛋白质的遗传密码和氨基酸序列。然而，难以去除由遗传密码所强加的将蛋白质局限于二十种遗传编码的标准结构单元(building block)(其中极少见的特例为，硒代半胱氨酸(selenocysteine)(例如参看 A.Bock 等人，(1991), Molecular Microbiology5:515-20)和卩比咯赖氨酸(pyrrolysine)(例如参看 G.Srinivasan 等人，(2002), Science296:1459-62))的约束。已取得一些进展来去除这些约束，但这一进展受到限制并且合理地控制蛋白质结构和功能的能力仍不成熟。举例来说，化学家们已开发出合成并且操纵小分子结构的方法和策略(例如参看 E.J.Corey, & X.-Μ.Cheng, The Loric of Chemical Synthesis(ffi I ey-1nter science, New York, 1995))。全合成(例如参看 B.Merri fie Id, (1986), Science232:341-7 (1986))和半合成方法(例如参看 D.Y.Jackson 等人,(1994) Science266:243-7 ；和 P.E.Dawson, & S.B.Kent, (2000)，Annual Review of Biochemistry69:923-60)使得合成肽和小蛋白质成为可能，但这些方法限制了 10千道尔顿(kiloDalton, kDa)以上蛋白质的效用。诱变方法尽管有效，但也局限于有限数量的结构改变。在多种情况中，在整个蛋白质中竞争性并入常见氨基酸的结构极其接近的类似物已成为可能。例如参看 R.Furter, (1998), Protein Science 7:419-26 ;Κ.Kirshenbaum 等人,(2002).ChemBioChem3:235-7 ；和 V.Poring 等人,(2001).Science 292:501-4。化学肽连接和天然化学连接描述于美国专利第6，184，344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO 02/098902和WO 03/04223中，这些专利都是以引用的方式并入本文中。Lu等人于Mol Cell.2001 Oct;8 (4):759-69中描述一种以化学方式将蛋白质与含有非天然氨基酸的合成肽连接的方法(称为蛋白质连接)。早期的工作证实，大肠杆菌(E.coli)的翻译机器将容纳结构与常见二十种氨基酸类似的氨基酸。参看 Hortin, G.和 Boime, 1.(1983)Methods Enzymol.96:777-784。通过放宽内源性大肠杆菌合成酶的特异性从而使其活化非天然氨基酸以及其同类天然氨基酸，使这项工作得以进一步扩充。此外，经证实，也可以使用编辑域的突变来扩充内源性合成酶的底物范围。参看Doring, V.等人，(2001) Science 292:501-504。然而，这些策略局限于重新编码遗传密码而非扩展遗传密码，并且产生非天然氨基酸对常见二十种氨基酸中的一种的不同程度的取代。随后证实，可通过将以化学方式氨酰 基化的正交琥珀抑制性tRNA加到活体外转录/翻译反应中而在活体外将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。例如参看 Noren, CJ.等人(1989) Science 244:182-188 ；Bain, J.D.等人,(1989) T.Am.Chem.Soc.111: 8013-8014 ;Dougherty, D.A.(2000) Curr.0pin.Chem.Biol.4, 645-652 ；Cornish, V.ff.等人(1995) Angew.Chem.1nt.Ed.34: 621-633: T.A.Ellman 等人，(1992).Science255:197-200 ；和 D.Mendel 等人，(1995).Annual Review ofBiophysics and Biomolecular Structure 24:435-462。这些研究表明，核糖体和翻译因子可与大量非天然氨基酸、甚至具有不常见结构的氨基酸相容。不幸的是，tRNA的化学氨酰基化很难，并且这种方法的化学计量特性极大限制了能够产生的蛋白质的量。已将非天然氨基酸显微注射到细胞中。举例来说，通过显微注射以化学方式错酸基化的嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila) tRNA (例如，Μ.E.Saks 等人(1996), Anengineered Tetrahymena tRNA Gln for in vivo incorporation of unnatural aminoacids into proteins by nonsense suppression, T.Biol.Chem.271:23169-23175)和相关mRNA而将非天然氨基酸引入爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)中的烟碱型乙酰胆喊受体中(例如，M.ff.Nowak 等人(1998)，In vivo incorporation of unnaturalamino acids into ion channels in Xenopus oocyte expression system.MethodEnzymol.293:504-529)。还参看D.A.Dougherty (2000), Unnatural amino acids as probesof protein structure and function，Curr.0pin.Chem.Biol.4:645-652和M.ff.Nowak，P.C.Kearney, J.R.Sampson, Μ.E.Saks, C.G.Labarcaj S.K.Silverman, W.G.Zhongj J.Thorsonj J.N.Abelsonj N.Davidson, P.G.Schultz, D.A.Dougherty 和 H.A.Lester, Science^268:439(1995)。将爪蟾卵母细胞与活体外制得的以下两种RNA物质共注射:编码在所关注的氨基酸位置处具有UAG终止密码子的靶蛋白的mRNA，和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制性tRNA。随后所述卵母细胞的翻译机器将非天然氨基酸插入UAG指定的位置处。不幸的是，这种方法局限于细胞中可进行显微注射的蛋白质，并且由于相关tRNA是在活体外以化学方式酰基化并且无法再酰基化，故蛋白质的产率极低。为克服这些缺点，将新颖组件(例如，正交tRNA、正交氨酰基tRNA合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在细胞中制造在特定位置处具有所选氨基酸的抗体或抗体片段多肽的方法，所述方法包含：使所述细胞在适当培养基中生长，其中所述细胞包含核酸，所述核酸包含至少一个选择性密码子并且编码多肽；和提供所述所选氨基酸；其中所述细胞另外具有：正交tRNA（O‑tRNA），其在所述细胞中起作用并且识别具有选自由SEQ ID NO:2及其互补聚核苷酸序列编码的序列组成的群组的核酸序列的选择性密码子；和正交氨酰基tRNA合成酶（O‑RS），其中所述O‑RS利用所述所选氨基酸使所述O‑tRNA氨酰基化。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：芬·蒂昂，
申请(专利权)人：AMBRX公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。