一种顺序富集多磷酸化肽和单磷酸化肽的方法技术

本发明专利技术涉及生化分析领域，公开了一种分离富集磷酸化肽的方法。本方法使用反相/强阳离子交换混合模式材料为富集材料，通过优化缓冲盐类型和浓度，有机溶剂种类和浓度等参数，首次实现了多磷酸化肽和单磷酸化肽的顺序洗脱和选择性富集。和常规的金属氧化物富集方法相比，反相/强阳离子交换混合模式材料富集磷酸化肽具有更高的灵敏度，更高的选择性，更高的多磷酸化肽回收率。此外，富集可在固相萃取(SPE)模式或者分散固相萃取模式下进行，操作简单，通量高，可重复性好，适用于复杂体系中磷酸化肽的选择性分离富集，结合质谱，该材料在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的实用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及磷酸化肽的富集，具体地说是一种采用反相/强阳离子交换混合模式材料顺序富集多磷酸化肽和单磷酸化肽的方法。
技术介绍
可逆的蛋白质磷酸化在细胞生命活动中发挥着重要的调控作用，因此研究生物样品中的磷酸化蛋白对于揭示生命过程的调节机制是非常有意义的。生物质谱是解析磷酸化肽段结构的强有力工具，但是质谱在鉴定磷酸化蛋白方面仍然面临着巨大的挑战，主要是由于磷酸化肽的丰度低和质谱中大量非磷酸化肽段的信号抑制作用。因此，在质谱分析检测前对磷酸化肽进行选择性富集是十分必要的。目前，固定化金属亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2)是最常用的磷酸化肽的分离富集材料。其中IMAC是目前使用最广泛最传统的富集方法，但是与磷酸化肽共流出的酸性非磷酸化肽降低了此方法的选择性。TiO2方法因其此较高的磷酸化肽选择性在磷酸化蛋白组学中应用越来越多，但是多磷酸肽难于从TiO2材料上洗脱下来。近年来混合模式材料受到科研工作者的广泛关注，如反相/弱阴离子交换材料、亲水/阳离子交换材料和反相/强阳离子交换混合模式材料。这些材料中反相/强阳离子交换混合模式材料被填装在色谱柱中用于分离富集磷酸化肽。但是该方法富集磷酸化肽存在两点不足:不能有效分离多磷酸化肽和单磷酸化肽；柱色谱操作费时。将反相/强阳尚子交换材料与柱固相萃取模式或分散固相萃取模式有机的结合，可实现复杂混合物中磷酸化肽快速、简单、可重复、高通量地富集。因此，利用此材料的不同色谱作用机理，结合柱固相萃取模式或分散固相萃取模式的快速和简单等特性，实现多磷酸化肽和单磷酸化肽的选择性富集，可推动磷酸化蛋白组学的进步。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高选择性、高通量、简单、重复性好的磷酸化肽的分离富集方法，能对痕量多磷酸化肽和单磷酸化肽进行顺序选择性富集。采用反相/强阳离子交换混合模式材料与磷酸化蛋白酶解物接触，然后顺序富集多磷酸化肽和单磷酸化肽；所述反相/强阳离子交换混合模式材料是由两种或两种以上硅烷试剂在硅胶表面经过共聚反应形成，其结构式如下: NP P NP NP P NPI 1.1.1 1./.0" ■卜。-Sl‘、crSl‘、cr ■卜。-Sl‘、crSl(o ο οοο ο ο_I_I_I_I_I_I_ Silica Gel其中，Silica Gel为硅胶，NP为碳原子数为4 18的正链烷基，P为极性基团，包括以碳原子数为I 8的正链烷基相连接的氯原子、溴原子、氰基、苯磺酸基或磺酸基、羧基。富集材料为反相/强阳离子交换混合模式材料，材料的粒径是2-0 μ m,孔径为50-300 A。具体操作采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式；采用柱固相萃取(SPE)模式用反相/强阳离子交换混合模式材料顺序富集磷酸肽时，将磷酸化蛋白酶解物上到SPE柱上，采用洗脱溶剂台阶梯度，分别先后富集出多磷酸化肽和单磷酸化肽；或采用分散固相萃取模式用反相/强阳离子交换混合模式材料顺序富集磷酸肽时，将磷酸化蛋白酶解物上直接与富集材料混合，采用洗脱溶剂，使用离心方式、台阶梯度洗脱条件，分别先后富集出多磷酸化肽和单磷酸化肽。上样量为富集材料与蛋白酶解物质量比例为10-200: 1，富集温度为15_60°C。本专利技术具有如下优点:1.本专利技术制备的反相/强阳离子交换混合模式材料在分离富集磷酸化肽时表现出了高选择性和高通量等特点，可以实现多磷酸化肽和单磷酸化肽的有效分离和富集；2.本专利技术制备的反相/强阳离子交换混合模式材料既可以方便的装填成不同长度，不同内径的柱子，又可以直接添加与离心管，操作简单，易于重复。特别适合微量生物样品中磷酸化肽段的分离富集；3.本专利技术富集得到的磷酸化肽可直接用于电喷雾-质谱分析(ES1-MS)或者基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD-TOF MS)，提高了质谱的检测限和灵敏度。附图说明图1为萃取模式模式下对标准磷酸化蛋白a -casein (SOpmol)酶解产物中磷酸化肽经过不同方法富集后的ES1-MS谱图。(a) a -casein酶解产物经TiO2富集后的磷酸化肽馏分；(b) a -casein酶解产物经反相/强阳离子交换混合模式材料富集后的单磷酸化肽馏分；(c) a -casein酶解产物经反相/强阳离子交换混合模式材料富集后的多磷酸化肽馏分；(d) a -casein酶解产物直接去盐后的质谱图。图2为反相/强阳离子交换混合模式材料在离心模式下对标准磷酸化蛋白a -casein (80pmol)酶解产物中磷酸化肽富集前后的MALD1-TOF质谱图。(a) a-casein酶解产物经反相/强阳离子交换混合模式材料富集后的多磷酸化肽馏分；(b) a -casein酶解产物经反相/强阳离子交换混合模式材料富集后的单磷酸化肽馏分；(c) a -casein酶解产物经反相/强阳离子交换混合模式材料富集后的非磷酸化肽馏分。具体实施方式一种反相/强阳离子交换混合模式材料(郭志谋；梁图；金高娃；梁鑫淼，基于硅胶表面共聚反应的色谱分离材料及其制备，CN200910012845.1，2009)，是由两种或两种以上硅烷试剂在硅胶表面经过共聚反应形成， 其结构式如下:权利要求1.，其特征在于: 采用反相/强阳离子交换混合模式材料与磷酸化蛋白酶解物接触，然后顺序富集多磷酸化肽和单磷酸化肽； 所述反相/强阳离子交换混合模式材料是由两种或两种以上硅烷试剂在硅胶表面经过共聚反应形成，其结构式如下:2.按照权利要求1所述方法，其特征在于:富集材料为反相/强阳离子交换混合模式材料，材料的粒径是2-50 μ m,孔径为50- 300 A； 所述两种或两种以上硅烷试剂为非极性硅烷试剂和/或极性硅烷试剂。3.按照权利要求1所述方法，其特征在于: 具体操作采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式； 在柱固相萃取(SPE)模式下采用反相/强阳离子交换混合模式材料顺序富集磷酸肽时，将磷酸化蛋白酶解物上到以反相/强阳离子交换混合模式材料为填料的SPE柱上，采用洗脱溶剂梯度，分别先后富集出多磷酸化肽和单磷酸化肽； 或在分散固相萃取模式下采用反相/强阳离子交换混合模式材料顺序富集磷酸肽时，将磷酸化蛋白酶解物上直接与富集材料混合，采用洗脱溶剂，使用离心方式、台阶梯度洗脱条件，分别先后富集出多磷酸化肽和单磷酸化肽。4.按照权利要求3所述方法，其特征在于:样品的上样量为反相/强阳离子交换混合模式材料与磷酸化蛋白酶解物质量比例为10-200: 1，富集温度为15-60°C;磷酸化蛋白为α_酪蛋白、酪蛋白或卵清蛋白。5.按照权利要求3所述磷酸化肽分离富集方法，其特征在于: 富集多磷酸化肽时采用 的洗脱溶剂是体积浓度为10-50%的乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH2-6 ;洗脱溶液的用量为3-40倍柱体积的多磷酸化肽洗脱溶液。6.按照权利要求3所述磷酸化肽分离富集方法，其特征在于: 洗脱单磷酸化肽时采用的洗脱溶剂为下述溶剂之一， 1)含有2-50mM甲酸铵的体积浓度为10-50%乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH2.2-4.3 ； 2)含有2-50mM乙酸铵的体积浓度为10-50%乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH4.3-5.0 ； 3)含有2-50mM磷酸二氢钾的体积浓度为10-50%乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种顺序富集多磷酸化肽和单磷酸化肽的方法，其特征在于：采用反相/强阳离子交换混合模式材料与磷酸化蛋白酶解物接触，然后顺序富集多磷酸化肽和单磷酸化肽；所述反相/强阳离子交换混合模式材料是由两种或两种以上硅烷试剂在硅胶表面经过共聚反应形成，其结构式如下：其中，Silica Gel为硅胶；NP为碳原子数为4～18的正链烷基；P为含有负离子的极性基团，包括以碳原子数为1～8的正链烷基相连接的氯原子、溴原子、氰基、苯磺酸基、磺酸基或羧基。FDA0000107630940000011.tif

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀玲，郭志谋，梁鑫淼，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21