本发明专利技术涉及检测FLT3(Fms-like tyrosine kinase 3)基因近膜区的序列内部串联重复(internal tandem duplications，ITD)突变的试剂盒，特别是涉及以荧光PCR毛细管电泳技术检测临床样品中FLT3-ITD的试剂盒。本试剂盒主要包括PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒、以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量。本试剂盒对全血或骨髓样品中的FLT3-ITD的检测和分析具有很高的灵敏度和特异性，可广泛应用于白血病判断预后，指导治疗和预测疾病复发等多个领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3)基因近膜区的序列内部串联重复(internal tandem duplications, ITD)突变的试剂盒,特别是涉及以突光PCR毛细管电泳技术检测临床样品中FLT3-1TD的试剂盒。由于本试剂盒对全血或骨髓样品中的FLT3-1TD的检测和分析具有很高的灵敏度和特异性，可广泛应用于白血病判断预后，指导治疗和预测疾病复发等多个领域。
技术介绍
FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3)是III型受体酪氨酸激酶家族中的一员，其突变与白血病的发生密切相关。FLT3与其配体(FL)在造血干/祖细胞的增殖和分化中起重要的调节作用。FL与FLT3的细胞外结构域结合介导一系列细胞内信号传导途径，调节细胞增殖和活化。当FLT3发生基因突变时，可导致FLT3非配体依赖性磷酸化，破坏正常血细胞的增殖、分化与凋亡。FLT3突变有两种形式:一种为发生在FLT3基因近膜区的序列内部串联重复(internal tandem duplications, ITD),称为 FLT3-1TD 突变,ITD 的大小和位置都存在多态性，典型的ITD位于第14外显子，也可累及第14内含子和第15外显子；一种为发生在酪氨酸激酶结构区域的点突变，称为FLT3-TKD突变。目前有关于FLT3-1TD突变的研究表明FLT3-1TD突变最常出现在急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中，突变发生率为15% 35%，其次为骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes，MDS)，突变发生率约为2% 5%。FLT3-1TD在急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中发生率极低(低于1% )，而在慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、成人体细胞白血病中尚未发现FLT3-1TD突变。AML是一组起源 于造血干细胞的恶性血液病，具有高度异质性。在影响AML预后危险度的众多因素中，细胞遗传学已被认为是最重要的独立预后因素，一些特异性染色体核型异常，不仅成为AML诊断中的重要标志物，并常被认为是判断预后的标志。但是大约40 % 50 %的AML患者未检测到染色体核型异常，这些患者预后变异较大，5年生存率24% 42%。所以寻找核型正常AML患者的预后分子标志成为人们关注的焦点。随着分子遗传学检测方法的应用，学者们发现正常核型的AML患者在分子学水平上是存在异质性的，包括基因突变或某些特定基因的表达异常，为AML患者的进一步预后分级及分子靶向治疗提供了依据FLT3基因突变是已发现的影响AML患者预后的分子标志之一，可作为AML患者预后不良的独立指标。FLT3-1TD突变是AML患者中最常见的一种突变类型，约15% 35% AML病例存在FLT3-1TD突变，另外还有约7%的AML病例存在FLT3-TKD突变。但是目前大部分研究认为FLT3-TKD突变与AML预后无关，而FLT3-1TD突变与AML发病和发展密切相关，是一个重要的独立预后因素。FLT3-1TD阳性患者具有较独特的临床特征，目前针对于此突变的靶向治疗也已经进入不同的临床试验阶段。而且，不同ITD患者的预后也存在差别，这与ITD-AR(internal tandem allelic ratio,内部串联重复等位基因比例)值有关，即ITD:WT (FLT3野生型基因)比值，ITD-AR值增加可能导致预后不良，因此ITD-AR值也是AML患者的很强的独立预后因素。MDS患者FLT3-1TD突变相比于没有突变的患者，FLT3-1TD阳性患者转为AML的概率有增高趋势，进展为AML的时间有缩短趋势，且总体生存期缩短，MDS转为AML后，FLT3-1TD阳性率增高，因此FLT3-1TD是MDS转化为AML的高危因素，为预后不良因素。综上，FLT3-1TD可作为AML和MDS患者预后不良的独立指标，对FLT3-1TD基因突变进行检测可以帮助判断预后，用于指导治疗、判断疗效和疾病复发，对增加患者的长期生存率和生存质量有着非常重要的意义。FLT3-1TD基因突变检测试剂盒(荧光PCR毛细管电泳法)提供一种快速检测FLT3-1TD基因突变的方法。本方法根据PCR引物设计原理，分别在FLT3-1TD发生的14外显子和15外显子的两端设计上下游引物，对于发生FLT3-1TD基因突变的DNA标本，将会出现大于正常片段的扩增产物。本方法通过毛细管电泳方法检测PCR产物的长度来确定是否存在FLT3-1TD基因突变，并可以通过软件分析计算ITD-AR值，以期为AML和MDS的临床诊断、预后判断及分子靶向治疗提供理论依据。相比普通的琼脂糖凝胶电泳，该方法更加灵敏，且能准确判断突变条带的片段大小及基因剂量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种使用荧光PCR毛细管电泳技术检测白血病临床样品中FLT3-1TD基因突变的试剂盒。该试剂盒通过提取患者血液或骨髓的DNA，使用PCR方法扩增FLT3的ITD区域，然后使用荧光PCR毛细管电泳技术对ITD片段大小及剂量进行检测。为了实现本专利技术，我们采用了以下技术方案:(I)使用适当的核酸分析软件对已知的FLT3基因核苷酸序列进行同源性比较并找出同源区段的基础上 ，进一步使用适当的引物设计软件(例如Primer 3)选择并设计寡核苷酸引物。由于所设计的引物在FLT3-1TD发生的14外显子和15外显子的两端，而且与其他基因表达mRNA的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶，所以避免了 FLT3-1TD检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度；(2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的引物序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite0以FPLC层析法纯化荧光标记的引物。然后，可使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20% )电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针；(3)从得自受试者的外周血或者骨髓中提取DNA，然后使用PCR反应体系将其扩增；(4)提供包括(a)待检样品，(b)耐热DNA聚合酶和(C) 2_脱氧核苷三磷酸(dNTPs)的扩增反应体系，以及包括(d)能够与待检双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引物，(e)能够与待检双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物。通过一次或多次聚合酶链反应扩增所说的靶多核苷酸；通过荧光PCR毛细管电泳技术以检测靶多核苷酸的片段长度。本专利技术所提供的荧光PCR毛细管电泳技术检测临床样品中FLT3-1TD的试剂盒包括=(I)PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和⑵分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，(3)以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量。本专利技术的一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液包括5’端结合有荧光发生基团的正向引物、反向引物、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，特征在于所使用的引物序列分别为:5’ -FAM-TCTCCTCTTCATTGTCGTTTTA -3，(SE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测样品中FLT3‑ITD的试剂盒，试剂盒包括：(1)PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液包括5’端结合有荧光发生基团的正向引物、反向引物、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，(3)以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量，其特征在于所使用的正反向引物的序列可以为：5’‑FAM‑TCTCCTCTTCATTGTCGTTTTA‑3’、5′‑ATGGTGAGTACGTGCATTTTA‑3′；5’‑FAM‑TTCATTATTCTTTCCTCTATCTGC‑3’、5′‑TGTTGCGTTCATCACTTTTC‑3′；5’‑FAM‑AACTGCCTATTCCTAACTGACTC‑3’、5’‑TCCATAAGCTGTTGCGTTC‑3’；5’‑FAM‑GCCAGCTACAGATGGTACAGG‑3’、5’‑AGCATTTTGACGGCAACC‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李明，陈嘉昌，陈华云，高云，程钢，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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