一种制备针对糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法技术

本发明专利技术旨在提供一个制备针对糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法。该方法通过将稳定表达外源目的基因的细胞株免疫与宿主细胞同来源的小鼠，使用糖基化和非糖基化的目的蛋白对单克隆抗体同时进行筛选，以获得特异针对糖基化修饰蛋白的单克隆抗体杂交瘤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫化学、蛋白质化学和细胞生物学领域。具体而言，本专利技术涉及一种制备特异识别糖基化修饰蛋白的单克隆抗体的方法。
技术介绍
蛋白质的翻译后修饰状态与蛋白质功能密切相关，其中糖蛋白发挥了多种重要的生物功用，如细胞膜上的糖蛋白参与胚胎发育、细胞移动、免疫反应以及细胞分裂等过程。另外，大部分血浆蛋白都具有不同程 度的糖基化修饰。值得注意的是，现在已知的作为各种疾病检测标记物的蛋白质都是糖蛋白，如PSA，AFP，CA125，CA153和HER-2等。多年来，关于对血浆中的生物标记物的检测的研究取得了一定的进展。其中最重要的方法就是生产针对这些蛋白的抗体，通过ELISA的方法实现对这些蛋白的检测和定量。该方法的关键即是获得特异性好、灵敏度高的抗体。目前，传统的生产抗体的方法已经相当成熟且在大多数情况下非常有效，但是对于血浆中的这些糖蛋白抗体的生产，传统的方法往往存在一定的不足，这是由于具有天然糖基化修饰的蛋白难以获得，而且糖蛋白的抗原性往往不强。原核表达的蛋白，由于不具有糖基化修饰，籍此产生的抗体往往不能很好地识别人血液中的糖蛋白。糖蛋白抗体的生产通常可以通过富集和纯化生物体内的天然糖蛋白作为抗原，采用传统的抗体生产方法进行抗体制备。但是这种方法对于那些在生物体内含量较低，或者难于纯化的糖蛋白并不合适。而且更重要的是，在一系列体外操作过程中，对糖蛋白的各种性质是否造成不同程度的影响，也是不得而知的。因此为了克服以上困难，一些科学家已经研发出新的抗体制备方法以获得特异针对糖蛋白的抗体。McKenzie采用小鼠腹腔注射在其细胞膜上稳定表达外源糖蛋白Neu的肿瘤细胞作为免疫抗原的方法，刺激机体产生并筛选出针对该蛋白的单克隆抗体。在该方法中，将Neu基因导入到NIH3T3细胞中，使其在细胞膜上稳定表达。细胞通过腹腔注射入小鼠后，该蛋白的细胞外部分即可作为抗原刺激机体产生抗体。该方法克服了膜上糖蛋白难于富集纯化的困难，而且实验结果也表明，这种方法生产的抗体比依靠合成Neu蛋白上的肽段作为抗原生产出的抗体具有更好的特异性，可以区分与其相似性极高的蛋白。Atabai也通过类似的方法将稳定表达MFGE8蛋白的人的肿瘤细胞注射到兔子体内，通过筛选获得特异性单克隆抗体。Suzuki等将heparin的糖链连接到载体蛋白KLH上作为抗原，采用传统方法注射到小鼠体内，筛选出可特异识别该糖链的单克隆抗体。但是上述研究并没有能够提供一种应用性广泛的方法，而且实验操作比较复杂。本专利技术人以人AGP为例，试图建立一套可生产特异识别糖基化蛋白的抗体的方案，由此生产的单克隆抗体可基本上克服糖蛋白抗原性低下和糖蛋白抗体特异性差的缺陷。将外源的糖蛋白基因通过逆转录病毒载体导入到小鼠黑色素瘤细胞B16中，经过筛选获得稳定表达株。该表达株可以持续地将外源糖蛋白分泌到细胞外。将稳定细胞株和佐剂混合后经皮下注射到C57BL/6J小鼠体内，随着细胞的不断增殖和生长，外源糖蛋白被持续分泌到小鼠体内作为抗原刺激机体产生抗体。将血清呈阳性反应的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合后，通过多次筛选，可以得到可特异识别外源糖蛋白的单克隆抗体。该方法与传统的生产糖蛋白单克隆抗体的方法相比具有明显的优势:在此过程中，细胞表达分泌的蛋白具有正确的糖基化修饰，不需对它们进行富集，而且这些抗原是持续性的分泌到小鼠体内，不断刺激机体的免疫系统，这样既解决了糖蛋白富集的难题，又解决了糖蛋白抗原性低的问题。我们采用该方法成功地生产了 AGP的单克隆抗体，这些抗体可以特异性的识别糖基化修饰的AGP，而对非糖基化的AGP几乎不具有识别能力。
技术实现思路
一 )本专利技术涉及制备特异识别糖基化修饰蛋白的单克隆抗体的方法，其中包括:I)将含有带有RFP标签的外源基因AGP的逆转录病毒载体转染病毒包装细胞，收集病毒后感染B16细胞，并通过药物处理进行稳 定株的筛选，通过RFP抗体检测稳定株对这些糖蛋白的分泌；2)将所得的稳定株与弗氏完全佐剂混合后，经皮下注射到C57BL/6J小鼠脾脏侧的腰窝处；3)使用弗氏完全佐剂进行腹部皮下注射以增强免疫反应；4)使用人血浆蛋白和原核表达的AGP对单克隆抗体同时进行筛选，以获得特异针对糖基化修饰蛋白的单克隆抗体；5)对这些单克隆抗体的检测和评估。二)本专利技术选择了分泌蛋白作为抗原，该抗原可以分泌到细胞外，直接入血，刺激机体产生体液免疫反应。与传统的抗体生产方法不同，该抗原是随着细胞的生长而不断持续被分泌到细胞外的。因此，引起的刺激也是连续性的。在细胞和宿主选择方面，黑色素瘤细胞B16即是宿主C57BL/J6小鼠来源的，因此，注射了稳定株细胞的小鼠只对外源性的分泌糖蛋白有免疫反应，而不会对B16细胞自身来源的其他任何蛋白有免疫反应。这一策略保证了生产出的抗体的单一性和优越性。而B16细胞是一种易转染、对外源基因可以稳定高效表达的细胞。三)本专利技术对标签蛋白红色荧光蛋白RFP的引入同时考虑到了三方面的因素:1)由于RFP基因是融合在外源糖蛋白的C端，因此，它不会对蛋白的分泌产生影响，而在整个转染、感染和筛选的过程中，红色荧光可以表明转染、感染效率以及外源蛋白在细胞内的表达状况；2)在对筛选到的稳定株进行检测时，RFP抗体可以作为一个有效的工具，对外源糖蛋白的分泌进行测定；3)作为一种载体蛋白，RFP可以增加肌体对糖蛋白的免疫反应。该原理类似于在使用多肽作为免疫原时采用KLH作为载体蛋白增强免疫反应。这是由于糖蛋白上的糖链作为一种半抗原降低了糖蛋白的抗原性，因此使用分子量较大的RFP(28Kd)，而不是通常用的HIS-Tag等作为融合蛋白。四)本专利技术倾向于选择采用逆转录病毒作为载体将外源基因导入到B16细胞中。这是因为对一些基因长度比较大的糖蛋白来说，在与RFP基因融合后的基因长度过大不利于采用传统的直接转染的方法进行稳定株的筛选。而逆转录病毒却可以包装比较大的基因片断，而且它的感染效率往往很高，可以大大缩短筛选稳定株所需的时间。但本专利技术同样也涉及其他转染方法在该抗体生产过程中的应用。五)本专利技术采用脾脏侧腰窝处的皮下注射免疫。这主要是考虑到以下几个方面:I)首先机体内产生免疫反应的重要器官即是脾脏；2)在众多的免疫方式中，抗原的直接脾脏免疫方式已经被证明是一种更加有效的选择。但是，这种注射方法对于机体的影响显著，很可能造成动物的死亡。在本专利技术中，由于B16是一种恶性程度高、易转移的肿瘤细胞，很易导致小鼠的死亡。如果将B16细胞直接注射小鼠脾脏内，则在很短时间内就可能导致小鼠的死亡，而此时有效抗体还没有大量产生。六)本专利技术首创佐剂与细胞混合注射。佐剂的使用在抗原呈递过程中起到关键的作用，可以大大提高抗体的产生。在本专利技术中，佐剂与细胞混合注射后，虽然会杀死部分细胞，但是存活的细胞一旦分泌出糖蛋白后，其周围的佐剂就会及时对这些抗原进行呈递，增加抗体的产生。我们的实验亦表明佐剂的混合注射会明显提高抗体的产出。而在细胞注射后，单独的佐剂腹下注射也是为了增强肌体的免疫反应。七)本专利技术所涉及的生产单克隆抗体的技术可适用于生产针对跨膜及膜外蛋白(如细胞基质类蛋白)的抗体。这是由于将这些基因转入B16细胞后，这些位于细胞外的蛋白或蛋白中的一部分可以作为抗原持续性的刺激机体产生抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备单克隆抗体的方法，其特征在于制备特异性识别糖基化修饰的蛋白的抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：任艳，韦汉福，潘秦，刘玲，徐宁志，刘国振，吴琳，刘斯奇，
申请(专利权)人：北京华大蛋白质研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11