本发明专利技术提供了一种感染VSV动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括重组蛋白抗原、多孔酶联板、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、酶标二抗、终止液、TMB底物溶液、阴性对照血清和阳性对照血清；所述检测方法包括以下步骤：包被重组蛋白；将待测血清倍比稀释后孵育；加入酶标二抗；显色；加入终止液终止反应；检测OD值，以P/N值＞2.1作为阳性标准，以出现阳性反应的最高稀释度作为样品的抗体滴度。本发明专利技术可对大量样品同时进行检测，操作方便，能够快速稳定检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体，适用于感染VSV动物的快速诊断，有利于及时监测入境动物的VSV感染情况。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种抗体检测试剂盒及其检测方法，具体地，涉及ー种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
水泡性ロ炎(Vesicular stomatitis, VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus, VSV)引起的ー种急性高度接触性传染病，马、牛、猪等动物较易感。临床上以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水泡病变为主要特征。VS在临床症状上很难与ロ蹄疫(FMD)、猪水疱病(SV)、猪水疱性疹(VES)区别开来。据国际兽医局(OIE)报道，南美、中美几乎所有的国家和地区以及北美的美国等国家在1996-2002年暴发了大面积的VS流行，造成严重的经济损失。VS常呈季节性暴发，多在夏秋季(7 8月)发生，秋末趋于平息。节肢动物可能在病毒的传播中起到一定的作用，许多病例还表现为地方流行性及易感动物间的直接传播，水泡性ロ炎被OIE列为A类疾病，在我国其为外来动物传染病，还未有大規模爆发的报道，国家进出境动物检疫对象中将VSV列为ニ类疫病。VSV分为两个血清型，一是印地安那型(VSVind)，另ー是新泽西型(VSVw)。VSV基因组为线状单股负链RNA，全长约11Kb，从RNA的3’到5’端依次排列着5个相互不重叠的基因，分别编码病毒的核衣壳蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、囊膜蛋白(G)和病毒RNA复制酶(L)。VSV M蛋白是ー个分子量约26kDa的非糖基化的蛋白，是导致VSV致病性的重要毒力因子，M蛋白在细胞内具有多重功能，包括稳定病毒囊膜上的G蛋白三聚体；參与病毒体装配；抑制病毒RNA合成等，更重要的是，它可以阻遏宿主细胞mRNAs由胞核向胞外的转运，并以此有效地干扰宿主细胞表达抗病毒I型干扰素，使得病毒得以在宿主内有效复制。目前，监测VSV感染动物抗体主要采用中和实验，而对重要毒力因子M蛋白的抗体还无有效的监测方法，因此，开发出一种能够快速诊断VSV感染的试剂盒成为当务之急。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷而提供ー种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及其检测方法，本专利技术提供的试剂盒能够快速检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体，耗时少，使用方便，而且结果特异性强、敏感性高，有利于及时监测入境动物的VSV感染情況。本专利技术的第一个目的通过以下技术方案实现，ー种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒，包括重组M蛋白抗原、多孔酶联板、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、HRP标记的羊抗鼠IgG、终止液、TMB底物溶液、阴性对照血清和阳性对照血清。优选的，所述重组M蛋白抗原为TrxA-M重组蛋白抗原或含GST标签的重组M蛋白抗原。优选的，所述TrxA-M重组蛋白抗原通过以下步骤制备:步骤一，根据VSV基因组序列设计引物对VSV M基因进行PCR扩增；步骤ニ，将质粒pET32a(+)和PCR扩增得到的所述M基因分别用BamHI与HindIII双酶切并分别回收，用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态菌株，37°C培养过夜后，挑取菌落进行培养后抽提质粒DNA，进行BamHI与HindIII双酶切鉴定和DNA测序鉴定，获得pET32a-M质粒；步骤三，将所述pET32a-M质粒转化大肠杆菌BL21表达宿主菌，以终浓度为ImM的IPTG诱导TrxA-M重组蛋白的表达；步骤四，超声破碎所述宿主菌，12000rpm离心30min,对破碎菌体上清及沉淀分别采用12%的SDS-PAGE检测目的蛋白；步骤五，采用N1-NTA Resin纯化所述重组蛋白，采用12%的SDS-PAGE胶鉴定纯化产物，并用VSV小鼠康复血清及His单克隆抗体进行Western-blotting鉴定M蛋白。优选的，所述包被缓冲液为pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液。优选的，所述封闭缓冲液由含3%的脱脂奶粉的PBS和0.05% Tween20组成，所述百分比为重量体积百分比。优选的，所述洗涤缓冲液为pH7.4的0.15M PBS0优选的，所述样品稀释液由0.1gBSA加所述洗涤缓冲液至IOOmL而获得。优选的，所述多孔酶联板为40孔或96孔的聚苯こ烯塑料板。优选的，所述终止液为2M硫酸。本专利技术的第二个目的通过以下技术方案实现，一种应用上述试剂盒检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体的方法，包括以下步骤:步骤一，重组M蛋白抗原用0.05M pH9.6的碳酸缓冲液稀释，4°C包被过夜，洗涤缓冲液洗涤；步骤ニ，用封闭缓冲液37°C封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；步骤三，将待测血清用样品稀释液倍比稀释后，37°C孵育2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；步骤四，加入用封闭缓冲液稀释为1: 5000的HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育1.5h，用洗涤缓冲液洗涤；步骤五，于各反应孔中加入TMB底物溶液0.1mL, 37°C保温10 30分钟；步骤六,于各反应孔中加入0.05mL终止液；步骤七，在ELISA检测仪上，于450nm处以空白对照孔调零后测各孔OD值，以待测血清OD值/阴性对照OD值(P/N) > 2.1作为阳性标准，以出现阳性反应的最高稀释度作为该血清样品的抗体滴度。优选的，所述重组M蛋白抗原的包被浓度为12.5 ii g/mL。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果:本专利技术提供的试剂盒，可对大量样品同时进行检测，操作简单方便，结果特异性强、敏感性高，能够快速稳定检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体，适用于各种感染VSV动物的快速诊断，有利于及时监测入境动物的VSV感染情況。附图说明通过阅读參照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显:图1是VSV M基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳结果图，其中泳道I为DNA Marker,泳道2为扩增的VSV M基因；图2是重组VSV M基因在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE结果图，其中泳道I为蛋白Marker，泳道2为pET32a诱导表达，泳道3为pET32a_M未诱导，泳道4为pET32a_M诱导；图3是TrxA-M重组蛋白纯化产物的SDS-PAGE结果图，其中泳道I为蛋白Marker，泳道2为pET32a-M表达产物纯化；图4是重组蛋白采用抗His的Western-Blotting鉴定结果图，其中泳道I为pET32a空质粒表达产物，泳道2为pET32a_M未诱导表达，泳道3为pET32a_M诱导表达，泳道4为pET32a-M表达产物纯化；图5是重组蛋白采用VSV康复血清的Western-blotting鉴定结果图,其中泳道I为pET32a空质粒表达产物，泳道2为pET32a_M未诱导表达，泳道3为pET32a_M诱导表达，泳道4为pET32a-M表达产物纯化；图6是不同M蛋白包被稀释度的P/N值变化规律图；图1是不同剂量VSV感染的BALB/c小鼠体重变化图；图8是不同剂量VSV感染的BALB/c小鼠体内的M蛋白抗体消长规律图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Samb本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括重组M蛋白抗原、多孔酶联板、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、HRP标记的羊抗鼠IgG、终止液、TMB底物溶液、阴性对照血清和阳性对照血清。
【技术特征摘要】
1.一种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括重组M蛋白抗原、多孔酶联板、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、HRP标记的羊抗鼠IgG、终止液、TMB底物溶液、阴性对照血清和阳性对照血清。2.按权利要求1所述的感染VSV的动物体内M蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述重组M蛋白抗原为TrxA-M重组蛋白抗原或含GST标签的重组M蛋白抗原。3.按权利要求2所述的感染VSV的动物体内M蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述TrxA-M重组蛋白抗原通过包括以下步骤的方法制备而得: 步骤一，根据VSV基因组序列设计引物对VSV M基因进行PCR扩增； 步骤ニ，将质粒pET32a(+)和PCR扩增得到的所述M基因分别用BamHI与HindIII双酶切并分别回收，用T4连接酶连接，连接产物转化DH5 a感受态大肠杆菌菌株，37°C培养过夜后，挑取菌落进行培养后抽提质粒DNA，进行BamHI与HindIII双酶切鉴定和DNA测序鉴定，获得pET32a-M质粒； 步骤三，将所述pET32a-M质粒转化大肠杆菌BL21表达宿主菌，以终浓度为ImM的IPTG诱导TrxA-M重组蛋白的表达； 步骤四，超声破碎所述宿主菌，12000rpm离心30min,对破碎菌体上清及沉淀分别采用12%的SDS-PAGE检测目的蛋白； 步骤五，采用N1-NTA Resin纯化所述重组蛋白，采用12%的SDS-PAGE胶鉴定纯化产物，并用VSV小鼠康复血清及His单克隆抗体进行Western-blotting鉴定M蛋白。4.按权利要求1所述的感染VSV的动物体内M蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙涛，方心葵，张世宽，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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