本发明专利技术涉及生化分析领域，公开了一种复杂体系中痕量内源性磷酸化肽的富集方法。本发明专利技术首次采用滤膜(ultrafiltration?membrane)去除血清中的大量高丰度蛋白、DNA和RNA等大分子量干扰化合物，在降低样品复杂度的同时，减少了在上样过程中与磷酸化肽竞争作用位点的干扰物，显著地提高了金属氧化物富集内源性磷酸化肽的选择性和检测灵敏度。与此相比，血清样品不经过滤膜过滤，金属氧化物富集不到内源性磷酸化肽。该方法结合滤膜截留和金属氧化物富集实现了血清中痕量内源性磷酸化肽的高灵敏度、高选择性富集和检测，为肿瘤生物标志物的发现奠定了方法学基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生化分析领域，具体地说是滤膜过滤结合金属氧化物在富集内源性磷酸化肽中的应用。
技术介绍
蛋白质磷酸化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰(Post TranslationalModifications, PTMs),参与并调控着生命活动的几乎所有过程,包括细胞增殖、分化,神经活动和新陈代谢等。异常的蛋白质磷酸化是人类疾病发生的根本原因之一。所以建立高灵敏度和高通量的磷酸化蛋白检测方法，对于进一步理解生命进程、发现与疾病相关的生物标志物具有重要意义。目前由于生物样品中磷酸化肽的含量低，并且在质谱检测中大量的非磷酸化肽段严重抑制磷酸化肽的离子信号，导致对磷酸化蛋白的鉴定具有挑战性。因此在质谱分析前高选择性的富集内源性磷酸化肽非常重要。固定金属离子亲和色谱(IMAC)如Ga3+-1MAC和Fe3+-1MAC和金属氧化物亲和色谱(MOAC)如TiO2等因其对磷酸化肽的高选择性被广泛应用于磷酸化蛋白组学研究中。血清中含有来源于几乎所有细胞、组织的蛋白及代谢产物，能够直接反映机体的生理、病理状况,是对各种疾病研究的最有价值的样本之一。但由于血清成分极其复杂，同时具有很高的动态范围，使得血清中内源性磷酸化肽的检测面临巨大挑战，至今相关报道很少。Hu L.H.等利用一种基于有序介孔材料的固定化钛离子亲和色谱(Ti4+-1MAC)材料直接从人的血清中富集并检测到4个内源性磷酸化肽[Hu LH,Zhou HJ,Li YH，Sun ST7GuoLH, Ye ML, Tian XF, Gu JR, Yang SLjZou HF.Anal.Chem.,2009,81(1):94-104]。我们利用氧化锆(ZrO2)包覆介孔氧化硅材料直接从人血清中富集到12个内源性磷酸化肽[Wan HH,Yan JY, Yu L，Zhang XL，Xue XY, Li XL, Liang XM.Talanta,2010,82(5):1701-1707]。以上两种方法都是利用磷酸化肽中的磷酸根与富集材料中的金属元素相互作用实现了磷酸化肽的选择性富集。但是血清样品中含有大量的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及磷酸化蛋白等大分子化合物，这些化合物都含有磷酸根，特别是RNA和DNA中含有的大量的磷酸根。这些含有磷酸根的化合物可能在上样过程中与低丰度的磷酸化肽竞争富集材料上的作用位点，从而降低了血清中磷酸化肽的富集选择性。因此，如何有效地去除这些大分子量干扰化合物，提高血清中低丰度磷酸化肽富集检测方法至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，能对痕量磷酸化肽进行选择性富集。本专利技术采用的技术方案为:，首先将血清样品采用滤膜(ultrafiltration membrane)截留、去除血清中的大量蛋白、DNA和RNA等大分子量干扰化合物，降低了样品的复杂性，然后利用金属氧化物富集滤膜滤过液中的痕量内源性磷酸化肽；所述滤膜的截留分子量在5000_20000Da之间；所述金属氧化物材料包括氧化钛、氧化锆、氧化铝、或者这些金属的复合金属氧化物中的一种或二种以上。金属氧化物材料的粒径大小为0.2-100微米，孔道直径大小为1-100纳米。滤膜截留的具体操作采用离心模式；在离心模式下，血清样品经溶液稀释后，转移至滤膜管中，用离心机离心，得到过滤液；血清样品稀释时采用的稀释溶液为下述溶剂之一，I)体积浓度为5-60%甲醇，pH 2-7 ；2)体积浓度为1-20%乙腈，pH 2-7 ；3)体积浓度为1-40%乙醇溶液，pH 2-7 ；稀释溶液的用量为2-20倍血清样品体积。离心温度为4_35°C，离心速率为5000_20000g，离心时间是0.1-48小时。金属氧化物富集磷酸化肽的具体操作采用柱固相萃取模式或在离心模式；在柱固相萃取(SPE)模式下采用金属氧化物富集磷酸肽时，将滤膜的过滤液旋干后，采用冲洗溶剂溶解样品后上样到以金属氧化物为填料的SPE柱上，采用冲洗溶剂洗去非磷酸化肽，利用洗脱溶剂富集磷酸化肽；或在离心模式下，将滤膜的过滤液与金属氧化物混合，采用冲洗溶剂洗脱、离心洗去非磷酸化肽，利用洗脱溶剂洗脱、离心富集得到磷酸化肽；冲洗非磷酸化肽时采用的冲洗溶剂为下述溶剂之一，I)含有30-500mg/mL乳酸的体积浓度为20-90 %乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH2.0-4.3 ；2)含有1% -5%三氟乙酸的体积浓度为20-90%乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH 1-3 ；3)含有1% -5%甲酸的体积浓度为20-90%乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH 1-4 ;洗脱磷酸化肽时采用的洗脱溶剂为下述溶剂之一，I)体积浓度为1-10%的氨水溶液，pH 10-13 ；2)体积浓度为1-10%的吡咯溶液，pH 10-13。金属氧化物与滤膜的过滤液质量比例为10-200: 1，富集温度为4_60°C。冲洗溶液的用量为3-40倍金属氧化物体积的冲洗溶液；洗脱溶液的用量为3-40倍金属氧化物体积的洗脱溶液。本专利技术具有如下优点:1.本专利技术在富集磷酸化肽时表现出了高选择性、高灵敏度和高通量等特点，可以实现痕量磷酸化肽的有效分离和富集；2.本专利技术采用滤膜或超滤膜去除了血清中大量的含有磷酸根的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及磷酸化蛋白等大分子化合物，减少了这些含有磷酸根的化合物在上样过程中与低丰度的磷酸化肽竞争富集材料上的作用位点，从而提高了血清中磷酸化肽的富集选择性和质谱的检测灵敏度。3.本专利技术采用滤膜在离心模式下截留大分子化合物，金属氧化物在柱固相萃取模式或在离心模式磷富集磷酸酸化肽，滤膜截留和金属氧化物富集均可实现样品的大批量处理，从而提高了血清中磷酸化肽的高通量样品处理。附图说明图1添加有-酪蛋白酶解物的血清样品分别经过(A) 50 % CH30H/0.1 % FA和(B) 10% ACN/0.1% FA稀释后，再经TiO2富集后的质谱图。★:磷酸化肽。图2.分别添加有⑷ 160pmol、(B)80pmol、(C)20pmol 和(D) 8pmol_ 酪蛋白酶解液的混合液经过所建立方法处理后的质谱图。★:磷酸化肽。具体实施例方式本专利技术提供一种复杂体系中痕量内源性磷酸化肽的富集方法，下面结合附图通过具体实施例对本专利技术作进一步说明 ，但本专利技术不受这些实施例的限制。具体操作时，过程如下:在离心模式下，血清样品经2-20倍血清体积的溶液稀释后，转移至截留分子量在5000-20000Da之间滤膜管中，离心温度为4_35°C，离心速率为5000_20000g，离心时间是0.2-48小时，得到过滤液。金属氧化物富集滤膜过滤液中的磷酸化肽的具体操作采用柱固相萃取模式；在柱固相萃取(SPE)模式下采用金属氧化物富集磷酸肽时，将滤膜的过滤液上到以金属氧化物为填料的SPE柱上，采用3-40倍柱体积的20-90%有机冲洗溶液(pH 1-4)洗去非磷酸化肽，利用3-40倍柱体积的体积浓度为1-10%的碱性溶液(pH 10-13)洗脱溶剂富集磷酸化肽。本专利技术以下实施例所使用的一种滤膜为商品化超滤管(Millipore，马萨诸塞州，美国)，所使用的一种金属氧化物材料为商品化TiO2 (GLSciences,东京，日本)。样品溶液的制备:将Img磷酸化蛋白标准品-酪蛋白溶解于50mM碳本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种血清中痕量内源性磷酸化肽的富集方法，其特征在于：首先将血清样品采用滤膜截留，然后利用金属氧化物富集滤膜滤过液中的痕量内源性磷酸化肽；所述滤膜的截留分子量在5000?20000Da之间；所述金属氧化物材料包括氧化钛、氧化锆、氧化铝、或者这些金属的复合金属氧化物中的一种或二种以上。
【技术特征摘要】
1.一种血清中痕量内源性磷酸化肽的富集方法，其特征在于: 首先将血清样品采用滤膜截留，然后利用金属氧化物富集滤膜滤过液中的痕量内源性磷酸化肽； 所述滤膜的截留分子量在5000-20000Da之间； 所述金属氧化物材料包括氧化钛、氧化锆、氧化铝、或者这些金属的复合金属氧化物中的一种或二种以上。2.按照权利要求1所述方法，其特征在于: 金属氧化物材料的粒径大小为0.2-100微米，孔道直径大小为1-100纳米。3.按照权利要求1所述方法，其特征在于: 滤膜截留的具体操作采用离心模式； 在离心模式下，血清样品经溶液稀释后，转移至滤膜管中，用离心机离心，得到过滤液； 血清样品稀释时采用的稀释溶液为下述溶剂之一， 1)体积浓度为5-60%甲醇，pH2-7 ； 2)体积浓度为1-20%乙腈，pH2-7 ； 3)体积浓度为1-40%乙醇溶液，pH2-7 ； 稀释溶液的用量为2-20倍血清样品体积。4.按照权利要求3所述方法，其特征在于:离心温度为4-35°C，离心速率为5000-20000g，离心时间是0.1-48小时。5.按照权利要求1所述方法，其特征在于: 金属氧化物富集磷酸化肽的具体操作采用柱固相萃取模式或在离心模式； 在柱固相萃取模式下采用金属氧化物富集磷酸肽时，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李秀玲，万慧慧，梁鑫淼，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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