一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒。本发明专利技术的试剂盒在两管PCR体系中即可完成16个位点16种突变的检测，PCR扩增结束经一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样本基因型，整个操作在2～3小时即可完成，操作步骤少，耗时短，通量高，且检测位点多，突变覆盖率高；此外本发明专利技术的试剂盒采用均相检测、闭管操作，减少了PCR产物污染的可能性，且检测特异性高，结果容易判读。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种应用荧光PCR熔解曲线分析检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变的试剂盒。
技术介绍
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD deficiency)是最常见的人类酶缺陷病之一，其病因是G6H)基因突变导致葡萄糖-6-磷酸脱氢酶合成减少。然而，绝大部分患者的生活质量并没有因此降低，这主要是由于在我国出现的绝大部分Gero缺乏症患者只有在诱因的存在下才会出现相应的临床症状，因此，完全可以通过预先防范和及时接受正确的治疗而有效的避免上述情况的发生。所以在我国Gero缺乏症的高发区进行全民筛查是十分必要的。目前G6H)缺乏症的临床诊断方法包括生化检测方法和分子生物学检测方法，其中生化筛查是传统诊断方法，通过直接或者间接地测定G6ro的酶活性来筛查G6ro缺乏症的携带者和患者。主要包括进行定性检测的高铁血红蛋白还原试验、荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝(NBT)纸片法和进行定量检测的NBT定量法、NADPH定量比值法等。分子生物学方法是基于DNA的分析进行G6H)基因突变的检测，如反向点杂交(RDB)、PE/DHPLC、AS-PCR、PCR-SSCP、基因芯片等。生产厂家主要有杭州纽罗西敏生物科技有限公司和Solgent有限公司等。国内临床常用的方法为检测酶活性的生化检测法和反向点杂交法。生化检测方法虽然检测成本低、检测时间短，但其存在以下缺点:(I)对女性杂合子的检出率低，仅为2(T45%左右；(2)结果易受实验条件，操作人员等因素影响。 现有的分子检测方法虽然能较好地解决Gero缺乏症女性杂合子检测的问题，但是不同的方法有着自身的局限性。反向点杂交法是一种异相的突变检测方法，需要对PCR产物进行后续处理，操作步骤较多，容易引起污染，并且结果判读易受主观因素影响。PE/DHPLC对仪器要求设备高，应用性不强。AS-PCR检测的通量十分有限，而且需要PCR后处理，容易出现污染造成假阳性结果的发生。PCR-SSCP对实验条件要求严格，只能检测突变是否存在，对于突变的具体位置和类型还需要进一步的测序。此外，由于某些点突变类型对单链DNA的空间构象改变小，容易漏检。基因芯片技术不但成本高、操作复杂而且结果存在不同程度的假阳性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种应用荧光PCR熔解曲线分析检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变的试剂盒。本专利技术的技术方案如下:一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，该试剂盒包括:特异扩增五种突变位点c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T 和c.1388G>A所在序列的上游引物Fl和下游引物R1，其中，Fl的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，Rl的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；特异扩增三种突变位点c.871G>A、c.10040A和c.10240T所在序列的上游引物F2和下游引物R2，其中，F2的碱基序列如SEQ ID NO:3所示，R2的碱基序列如SEQ ID NO:4所示；特异扩增突变位点c.95A>G所在序列的上游引物F3和下游引物R3其中，F3的碱基序列如SEQ ID NO:5所不，R3的喊基序列如SEQ ID NO:6所不；特异扩增两种突变位点c.383T>C和c.392G>T所在序列的上游引物F4和下游引物R4，其中，F4的喊基序列如SEQ ID NO:7所不，R4的喊基序列如SEQ ID NO:8所不；特异扩增五种突变位点c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T 和 c.592C>T 所在序列的上游引物F5和下游引物R5，其中，F5的碱基序列如SEQ ID NO:9所示，R5的碱基序列如SEQ ID NO:10所示；以及用于检测上述十六种突变位点的荧光探针。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述荧光探针包括:用于检测突变位点c.13600T的荧光探针Pl，其碱基序列如SEQ ID NO: 11所示；用于检测突变位点c.871G>A的荧光探针P2，其碱基序列如SEQ ID NO:12所示；用于检测突变位点c.1004C>A和c.10240T的荧光探针P3，其碱基序列如SEQ IDNO:13所示；用于检测突变位点c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A 和 c.1387C>A 的荧光探针P4，其喊基序列如SEQ ID NO:14所不；用于检测突变位点c.95A>G的荧光探针P5，其碱基序列如SEQ ID NO:15所示；用于检测突变位点c.383T>C和c.392G>T的荧光探针P6，其碱基序列如SEQ IDNO:16所示；用于检测突变位点c.487G>A和c.493A>G的荧光探针P7，其碱基序列如SEQ IDNO:17所示；用于检测突变位点c.517T>C和c.519C>T的荧光探针P8，其碱基序列如SEQ IDNO:18所示；用于检测突变位点c.592C>T的荧光探针P9，其碱基序列如SEQ ID NO:19所示。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述荧光探针5’端的荧光基团包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold540、JOE、HEX、CAL Flour0range560、TAMRA、Cal FluorRed590、R0X、CAL Fluor Red610、TEXASRED、CAL Flour Red635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar705，所述荧光探针3’端的淬灭基团包括DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。在本专利技术的一个优选实施方案中，该试剂盒包括检测体系A和检测体系B，所述检测体系A 包括:1 XPCR buffer、IU Taq DNA 聚合酶、200 ii MdNTP、2.5mMMgCl2、上游引物FU F2各lpmo l、下游引物RU R2各5pmol及荧光探针PU P2、P3、P4各5pmol ；所述检测体系B 包括 IXPCR bufferUU Taq DNA 聚合酶、200 ii M dNTP,2.5mMMgCl2、上游引物F3、F4、F5各lpmol、下游引物R3、R4、R5各5pmol及荧光探针P5、P6、P7、P8、P9 各 5pmol ；上述IXPCR buffer 中包括:Tris_HCl pH8.510mM、KC150mM 和 50% (v/v)甘油。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述检测体系A和检测体系B的荧光PCR熔解曲线检测程序如下:(I) 50°C 2min,95°C IOmin(2)95°C 15s — 65°C 56°C 15s — 76°C 20s, 10 个循环，其中 65°C 56°C 15s 每个循环下降rc ；(3)95°C 15s — 55°C 15s — 76°C 20s, 50个循环，在55°C退火阶段采集荧光信号；(4)95°C Imin — 35°C 3min — 40°C 85°C，其中 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖?6?磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：特异扩增五种突变位点c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T和c.1388G>A所在序列的上游引物F1和下游引物R1，其中，F1的碱基序列如SEQ?ID?NO：1所示，R1的碱基序列如SEQ?ID?NO：2所示；特异扩增三种突变位点c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T所在序列的上游引物F2和下游引物R2，其中，F2的碱基序列如SEQ?ID?NO：3所示，R2的碱基序列如SEQ?ID?NO：4所示；特异扩增突变位点c.95A>G所在序列的上游引物F3和下游引物R3其中，F3的碱基序列如SEQ?ID?NO：5所示，R3的碱基序列如SEQ?ID?NO：6所示；特异扩增两种突变位点c.383T>C和c.392G>T所在序列的上游引物F4和下游引物R4，其中，F4的碱基序列如SEQ?ID?NO：7所示，R4的碱基序列如SEQ?ID?NO：8所示；特异扩增五种突变位点c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T和c.592C>T所在序列的上游引物F5和下游引物R5，其中，F5的碱基序列如SEQ?ID?NO：9所示，R5的碱基序列如SEQ?ID?NO：10所示；以及用于检测上述十六种突变位点的荧光探针。...

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括: 特异扩增五种突变位点 c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T 和 c.1388G>A 所在序列的上游引物Fl和下游引物R1，其中，Fl的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，Rl的碱基序列如SEQ ID NO:2所示； 特异扩增三种突变位点c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T所在序列的上游引物F2和下游引物R2，其中，F2的碱基序列如SEQ ID NO:3所示，R2的碱基序列如SEQ ID NO:4所示； 特异扩增突变位点c.95A>G所在序列的上游引物F3和下游引物R3其中，F3的碱基序列如SEQ ID NO:5所示，R3的碱基序列如SEQ ID NO:6所示； 特异扩增两种突变位点c. 383T>C和c.392G>T所在序列的上游引物F4和下游引物R4，其中，F4的喊基序列如SEQ ID NO:7所不，R4的喊基序列如SEQ ID NO:8所不； 特异扩增五种突变位点 c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T 和 c.592C>T 所在序列的上游引物F5和下游引物R5，其中，F5的碱基序列如SEQ ID NO:9所示，R5的碱基序列如 SEQ ID NO:10 所示； 以及用于检测上述十六种突变位点的荧光探针。2.按权利要求1所述的一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于:所述荧光探针包括: 用于检测突变位点c.13600T的荧光探针Pl，其碱基序列如SEQ ID NO: 11所示； 用于检测突变位点c.871G>A的荧光探针P2，其碱基序列如SEQ ID NO:12所示； 用于检测突变位点c.1004C>A和c.10240T的荧光探针P3，其碱基序列如SEQ ID NO:13所示； 用于检测突变位点c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A和c.1387C>A的荧光探针P4，其喊基序列如SEQ ID NO: 14所不； 用于检测突变位点c.95A>G的荧光探针P5，其碱基序列如SEQ ID NO:15所示； 用于检测突变位点c.383T>C和c.392G>T的荧光探针P6，其碱基序列如SEQ ID NO:16所示； 用于检测突变位点c.487G>A和c.493A>G的荧光探...

【专利技术属性】
技术研发人员：李庆阁，黄秋英，夏众敏，杨蓉，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门致善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：