本发明专利技术公开了一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，包括：杂交鹅掌楸转化受体的建立、农杆菌制备、侵染、脱菌培养和筛选培养。本发明专利技术以杂交鹅掌楸悬浮培养的单细胞作为遗传转化受体系统，通过农杆菌介导的方法，以GUS基因为报告基因，通过细胞学方法检测GUS基因的瞬间表达、长期表达、通过分子生物学方法检测等确定外源基因的高效转化。本发明专利技术采用杂交鹅掌楸单细胞起源的体细胞胚胎发生体系，有利于外源基因的导入，并降低了嵌合体的产生。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及杂交鹅掌楸遗传转化方法，具体涉及。
技术介绍
杂交鹅掌楸又名鹅掌楸(马褂木)，它是由南京林业大学叶培忠教授等首次通过人工杂交的方法，将分布在亚洲的中国杂交鹅掌楸与分布在北美洲的北美杂交鹅掌楸采用人工控制授粉方法育成的杂交树种。杂交鹅掌楸叶形奇特，花色艳丽，是优良的庭院栽培和园林观赏树种。同时，其树体高大，主干圆满通直，木材结构细致均匀，色浅，易干燥，易加工，纤维较长，是优良的制浆造纸、人造板及家具用材树种，社会需求量极大。但是杂交鹅掌楸生长周期长，应用常规手段育种具有较大的困难。因此必须依靠现代生物技术并与常规育种相结合，进而缩短育种周期，加速育种进程，营造优质人工林，缓解木材供需矛盾。基因工程是生物技术的核心，为林木遗传改良开辟了一条新的途径。林木基因工程是通过适合的基因转移技术，导入有用的外源基因，获得转基因植株，进行林木遗传改良或有关的研究。近年来，林木基因工程取得了较大的进展。目前，已有几百种植物得到遗传改良，在丰产，抗病，抗寒等领域广泛应用。农杆菌介导的遗传转化是外源DNA进入植物细胞最成功和应用最为广泛的方法，自1976年D.Cleene和D.Ley (1976)首次报导根癌农杆菌菌株B6 (LMG18)也能感染裸子植物受伤组织并产生冠瘿瘤(Crown gall)后，许多学者开始利用农杆菌进行木本植物的基因转移。在农杆菌介导的遗传转化过 程中，成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。所谓植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。目前，以植物体胚发生体系或体胚作为受体系统越来越受到重视。该系统的主要特点有四点:其一、组成胚状体的胚性细胞接受外源DNA能力很强，是理想的基因转化感受态细胞，而且这些细胞繁殖量大，同步性好，因此转化率很高；其二、胚状体个体间遗传背景一致，无性系变异小，成苗快，数量多，而且还可以制成人工种子，有利于转基因植株的生产和推广；其三、胚状体多为单细胞起源，转化获得的转基因植株嵌合体少；其四、胚状体具有两极，在发育过程中同时可分化出芽和根，形成完整的植株，减少了不定芽发育过程中生根困难的难题。
技术实现思路
专利技术目的:针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供，以建立稳定高效的杂交鹅掌楸遗传转化体系。技术方案:为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下: ，包括以下步骤:(O杂交鹅掌楸转化受体的建立:取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞，接入含有M13杂交鹅掌楸液体培养基的三角瓶中，230C，95r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，继代3次后建立出悬浮细胞系，即为杂交鹅掌楸转化受体； (2)农杆菌制备:先活化EHA105单菌落，在含有卡那霉素50mg/L、链霉素30mg/L的LB液体培养基中，28°C，280r/min振荡培养至0D_为0.6-0.8，4°C离心收集菌体，用杂交鹅掌楸液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右； (3)侵染:取3ml菌液加到杂交鹅掌楸转化受体中，并加入乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L。静置l-3min后，置于23°C、95r/min的恒温摇床中，继续振荡培养16 40h ； (4)脱菌培养:将杂交鹅掌楸悬浮细胞经400目及150目的筛子过筛，用杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目的筛子上的单细胞悬浮，置于23°C、95r/min的恒温摇床，振荡培养培养36h后，再用400目的筛子过筛一次，并用加有头孢霉素500mg/L的杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目筛子上的单细胞收集。并将单细胞以2mL每皿的浓度铺平板，培养基为加有头孢霉素500mg/L，约21天继代一次；继代一次后，可以观察到子叶胚； (5)筛选培养:待子叶胚成熟，并长到2cm左右，将其挑出，转到MS基本培养基上生长，其中加有头孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。步骤(1)中，取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞5mL，将其接种到250mL的三角瓶中，并在瓶壁轻轻敲散；量取50mL杂交鹅掌楸Ml3液体培养基加入三角瓶中，将材料置于23°C,95r/min的恒温摇床振荡培养。步骤(2)中，农杆菌制备，具体操作为: 1)将_70°C保存的EHA105菌液在冰上融化，用接种环蘸取少量菌液，接种到含有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB培养基上，将其置于28°C恒温培养箱中培养； 2)待其长出单菌落后，用接种环挑取单菌落，接种到含有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB培养基上,再活化一次,然后将其置于28°C恒温培养箱中培养； 3)待其长出单菌落后，用灭过菌的枪头挑取单菌落接种到含有IOmL加有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB液体培养基的三角瓶中，28°C、220r/min振荡培养； 4)约20h后，吸取2mL菌液，接种到含有50mL加有适量抗生素的LB液体培养基的三角瓶中，28°C、280r/min 振荡培养至 OD600 为 0.6-0.8 ； 5)待农杆菌培养到OD6tltl为0.6-0.8时，取25mL菌液于50mL离心管中，于5000r/min，4°C离心IOmin,去除上清,收集菌体； 6)用杂交鹅掌楸液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右。步骤(3 )中，共培养36 40h。所述的EHA105带有35S:⑶S基因和NPT-1I基因。步骤(5 )中，每21天继代一次，继代2次后，就可用于移栽。有益效果:与现有技术相比，本专利技术以杂交鹅掌楸悬浮培养的单细胞作为遗传转化受体系统，通过农杆菌介导的方法，以GUS基因为报告基因，通过细胞学方法检测GUS基因的瞬间表达、长期表达、通过分子生物学方法检测等确定外源基因的高效转化。本专利技术采用杂交鹅掌楸单细胞起源的体细胞胚胎发生体系， 有利于外源基因的导入，并降低了嵌合体的产生，具有很好的实用性。附图说明图1是杂交鹅掌楸的悬浮细胞系的显微照片 图2是杂交鹅掌楸体胚苗的显微照片 图3是PCR检测转化结果图；图中，泳道M为maker，泳道CK+为质粒pBI 121，泳道CK_为未经过转化的马褂木植株，泳道H2O为水，泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9为随机选取的⑶S细胞学检测为阳性的马褂木转基因植株； 图4是RT-PCR检测转化结果图；图中，泳道M为maker，泳道CK+为质粒pBI 121，泳道CK_为未经过转化的马褂木植株，泳道1，2，3，4，5为随机选取的PCR检测及⑶S细胞学检测显示阳性的植株。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。以下实施例中，所使用到的培养基配方如下，未特别列出的，为常规培养基。MS 基本培养基配方:1650mg/L NH4NO3,1900mg/L KNO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4.7H20,440mg/L CaCl2, 27.8mg/L FeSO4.7H20, 37.3mg/L Na2EDTA, 22.3mg/LMnSO4.H20,8.6mg/L ZnSO4.7H20,6.2mg/L H3BO3,0.83mg/L KI,0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）杂交鹅掌楸转化受体的建立：取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞，接入含有杂交鹅掌楸M13液体培养基的三角瓶中，23℃，95r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，继代3次后建立出悬浮细胞系，即为杂交鹅掌楸转化受体；（2）农杆菌制备：先活化EHA105单菌落，在含有卡那霉素50mg/L、链霉素30mg/L的LB液体培养基中，28℃，280r/min振荡培养至OD600为0.6?0.8，4℃离心收集菌体，用杂交鹅掌楸M13液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右；（3）侵染：取3ml菌液加到杂交鹅掌楸转化受体中，并加入乙酰丁香酮100μmol/L；静置1?3min后，置于23℃、95r/min的恒温摇床中，继续振荡培养16~40h；（4）脱菌培养：将杂交鹅掌楸悬浮细胞经400目及150目的筛子过筛，用Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目的筛子上的单细胞悬浮，置于23℃、95r/min的恒温摇床，振荡培养36h后，再用400目的筛子过筛一次，并用加有头孢霉素500mg/L的Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目筛子上的单细胞收集；并将单细胞以2mL每皿的浓度铺平板，培养基加头孢霉素500mg/L，约21天继代一次；继代一次后，可以观察到子叶胚；（5）筛选培养：待子叶胚成熟，长到2cm左右，将其挑出，转到MS基本培养基上生长，其中加有头孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。...
【技术特征摘要】
1.一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)杂交鹅掌楸转化受体的建立:取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞，接入含有杂交鹅掌楸M13液体培养基的三角瓶中，23°C，95r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，继代3次后建立出悬浮细胞系，即为杂交鹅掌楸转化受体； (2)农杆菌制备:先活化EHA105单菌落，在含有卡那霉素50mg/L、链霉素30mg/L的LB液体培养基中，28°C，280r/min振荡培养至0D_为0.6-0.8，4°C离心收集菌体，用杂交鹅掌楸M13液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右； (3)侵染:取3ml菌液加到杂交鹅掌楸转化受体中，并加入乙酰丁香酮lOOymol/L； 静置l_3min后，置于23°C、95r/min的恒温摇床中，继续振荡培养16 40h ； (4)脱菌培养:将杂交鹅掌楸悬浮细胞经400目及150目的筛子过筛，用Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目 的筛子上的单细胞悬浮，置于23°C、95r/min的恒温摇床，振荡培养36h后，再用400目的筛子过筛一次，并用加有头孢霉素500mg/L的Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目筛子上的单细胞收集；并将单细胞以2mL每皿的浓度铺平板，培养基加头孢霉素500mg/L，约21天继代一次；继代一次后，可以观察到子叶胚； (5)筛选培养:待子叶胚成熟，长到2cm左右，将其挑出，转到MS基本培养基上生长，其中加有头孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。2.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于:步骤(I)中，取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞5mL，将其接种到250mL的三角瓶中，并在瓶壁轻轻敲...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈金慧，王丹，施季森，成铁龙，王鹏凯，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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