一种敲除牛MSTN基因的打靶载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体PIII-MSTN，其可敲除牛MSTN基因第一、二外显子的全部和第三外显子的大部分，敲除的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；PIII-MSTN核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3，包含长约1.3kb和6.8kb的牛MSTN基因同源臂序列、无启动子的绿色荧光蛋白基因EGFP和自身带有启动子PGK的新霉素抗性基因Neor表达框架。本发明专利技术的启动子捕获型打靶载体PIII-MSTN可用于培育敲除了MSTN基因的转基因肉用牛。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学及生物
，涉及一种启动子捕获型打靶载体，具体地，涉及一种敲除牛MSTN基因的启动子捕获型打靶载体及其应用。
技术介绍
肌肉生长抑制素(MSTN)是特异性骨骼肌生长发育负调控因子，其活性的丧失或降低，会引起动物肌肉的过度发育，牛MSTN基因的自然突变会引发“双肌”现象。双肌牛比正常牛具有较高的瘦肉率和较好的肉质，且脂肪率低，口感良好，但国内现有品种中缺少“双肌”表型的牛。通过基因敲除技术构建了 MSTN基因突变纯合体小鼠，发现并验证了生长抑素基因突变鼠的体重比正常鼠大30%，而且这种差异在成年鼠中不受年龄和性别的影响(McPherron A C, 1997, Nature 387,83-90)。以双肌现象著称的比利时蓝牛(BelgianBlue)和皮德蒙特牛(piedmontese)就是MSTN基因发生自然突变。比利时蓝牛MSTN基因序列中的第3个外显子上缺失了 11个核苷酸，是导致MSTN基因阅读框发生移位，使MSTN被截短，不能发挥其生物的活性；皮尔蒙特牛则是由于第3个外显子发生了错误突变，导致了在成熟蛋白区内酪氨酸代替了保守的半胱氨酸，而在第I个外显子也发生了突变，造苯丙氨酸代替了亮氨酸，起结果均使肌肉生成抑制素的功能全部或者几乎全部丧失(KambadurR，1997，Genome Res 7 (9),910-916) MSTN基因的发现，为生物育种工作者提供了新的思路。但是，育种工作者利用现有的双肌动物进行繁育存在育种速度慢和杂交性状不稳定等问题。2000年，McCreath等利用体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞进行COLlAl基因的定点突变，并利用定点突变成功的细胞作为体细胞克隆的核供体，已经成功获得基因定点修饰的活的小羊，这为家畜类动物的基因修饰提供了有效的途径(McCreath，2000，Nature 405，1066-1069)。另外，研究表明，在体细胞中进行基因打靶，启动子捕获型打靶载体的效率比传统的有启动子打靶载体联合正负筛选策略的效率高出 100 倍左右(ffaldman A S，1992，Crit Rev Oncol Hematol 22(1)，127-128)。目前，在家畜MSTN基因敲除研究方面，国内外在载体构建方面做了大量的研究工作，获得了一些MSTN基因敲除细胞系。但动物出生的报道相对较少，其中利用启动子捕获型载体进行MSTN基因突变的就更加罕见。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体；本专利技术的另一个目的在于提供该启动子捕获型打靶载体的应用。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是从和牛耳部组织中提取牛的基因组DNA，根据Genebank报道的牛MSTN基因序列设计长短同源臂引物，通过PCR方法从基因组DNA中克隆同源臂，将同源臂分别克隆到表达载体，经过限制性内切酶酶切和测序分析确定同源臂的准确性后，采用酶切和连接的方法将长短同源臂分别连接到基础载体PIII中，最后通过限制性内切酶酶切鉴定同源臂连接的正确性，构建获得一种敲除牛MSTN基因的启动子捕获型打靶载体PII1-MSTN(构建过程参见图1)。MSTN基因的核苷酸序列在进化过程中高度保守，包括3个外显子和2个内含子，其中第三个外显子是它的成熟区；牛的MSTN基因位于2号染色体的近着丝粒端距离TGLA44(微卫星标记，ms) 3.1cM的位置，包括6691个碱基，3个外显子分别位于10134 10506、12335 12708和14741 15121位置上。基础载体PIII包含一个不含启动子的绿色荧光蛋白EGFP基因和一个含自身启动子PGK的新霉素抗性基因(Neolr)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本专利技术提供的启动子捕获型打靶载体为PII1-MSTN，包含MSTN基因长短同源臂3’同源臂和5’同源臂，PII1-MSTN载体中的MSTN基因同源臂序列能够靶向性界定并敲除基因组上的靶基因。所述的5’同源臂不包含MSTN基因自身启动子的全部序列，且最后一个碱基为MSTN第一外显子起始密码子上游最后一个碱基。所述5’同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO:1的8834 10133 ;3’同源臂核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 的 15091 21957。打靶载体PII1-MSTN可敲除牛MSTN基因第一、二外显子的全部和第三外显子的大部分，敲除的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；PII1-MSTN核苷酸序列如SEQ ID N0:3，包含长约1.3kb和6.8kb的牛MSTN基因同源臂序列、无启动子的绿色荧光蛋白基因EGFP和自身带有启动子PGK的新霉素抗性基因Neolr表达框架。当打靶载体与靶基因序列发生同源重组时，通过表达标记基因，从而确定PII1-MSTN载体中的MSTN基因同源臂序列靶向性界定并敲除基因组上的靶基因。本专利技术用于扩增上述MSTN基因同源臂的引物，分别包括5’同源臂和3’同源臂的上游序列和下游序列的两组PCR引物对。本专利技术提供了用 PCR方法扩增牛MSTN基因同源臂的具体引物:5’ 同源臂上游引物:TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC,5’ 同源臂下游引物:TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT ；3’ 同源臂上游引物:GATCCGCGGCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGT,3’同源臂下游引物:AATCCGCGGAGTAGAATGGTCTTGAATGGTTAGGA,下划线部分为酶切位点。本专利技术提供一种构建敲除MSTN基因启动子捕获型打靶载体的方法，包括如下步骤:I)提取牛组织基因组DNA ；2)利用上述引物用PCR方法从步骤I)的基因组DNA中克隆MSTN基因的长短同源臂，分别为3’同源臂和5’同源臂；3)将同源臂克隆到表达载体经限制性内切酶和测序分析进行鉴定；4)将鉴定正确的同源臂连接到基础载体PIII中，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，构建得到敲除牛MSTN基因的打靶载体。其中步骤2)所述的PCR方法扩增5’同源臂，其反应条件为:95°C变性50s，60°C复性50s，72°C延伸2min，共35个循环；所述的PCR方法扩增3’同源臂，其反应条件为:95°C变性50s，59。。复性50s，72。。延伸7min，共35个循环。G418 (Geneticin selective antibiotic 418)是一种抗生素类药物，当 Neor 基因被整合进真核细胞DNA后，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。本专利技术还提供一种敲除牛MSTN基因的方法，利用电转染的方法将打靶载体导入牛胎儿(50天胎龄)成纤维细胞中，根据置换型打靶载体的原理，如图2中打靶载体PII1-MSTN的同源臂序列N5mstn和N3mstn分别与野生型MSTN基因发生交换，获得中靶后MSTN基因序列，即MSTN基因的第一外显子和第二外显子的全部以及第三外显子的大部分被从基因组内置换掉，而取代它的是绿色荧光蛋白基因和新霉素抗性基因。发生正确本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体。

【技术特征摘要】
1.一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体。2.按权利要求1所述的打靶载体，其包含MSTN基因上下游同源臂3’同源臂和5’同源臂，所述5’同源臂的最后一个碱基为MSTN第一外显子起始密码子上游最后一个碱基，在同源臂之间还具有标记基因。3.按权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述5’同源臂核苷酸序列如SEQIDNO:1的8834 10133 ;3’同源臂核苷酸序列如SEQID NO:1的15091 21957。4.按权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述标记基因包括报告基因EGFP和带有启动子PGK的新霉素抗性选择基因Nec/。5.按权利要求1 4之一所述的打靶载体，其为PII1-MSTN，质粒图谱如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3o6.一种扩增权利要求1 5之一所述的打靶载体中MSTN基因同源臂的引物，其分别包括5’同源臂和3’同源臂的上游序列和下游序列的两组PCR引物对。7.按权利要求6所述的引物，其特征在于，所述引物为: 5’ 同源臂上游引物:TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC, 5’ 同源臂下游引物:TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT ； 3 ’ 同源臂上游引物:GATC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣凤，赵丽华，李雪玲，梁浩，云亭，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：